Communication scientifique
Séance du 3 janvier 2006

Le polymorphisme génétique des enzymes du métabolisme des médicaments. Une opportunité pour un traitement individualisé

MOTS-CLÉS : cytochrome p-450 enzyme system. methyltransferases.. pharmacogénétique
Xenobiotic-metabolizing polymorphic enzymes. An opportunity for individualized drug treatment
KEY-WORDS : cytochrome p450 enzym system. methyltransferases.. pharmacogenetics

Michel Lhermitte, Delphine Allorge et Franck Broly

Résumé

La réponse aux médicaments est souvent variable d’un individu à l’autre, rendant parfois leur utilisation difficile. Des facteurs génétiques affectant la pharmacocinétique et la pharmacodynamie des médicaments expliquent en grande partie cette variabilité individuelle. La pharmacogénétique étudie l’ensemble des mécanismes d’origine génétique intervenant dans la réponse aux médicaments, et a pour but l’optimisation des traitements médicamenteux, tant en termes d’efficacité que de sécurité d’emploi. Des polymorphismes génétiques affectant les gènes codant pour des enzymes, des transporteurs et des récepteurs ont été décrits, les conséquences sur la biodisponibilité et l’effet d’un grand nombre de médicaments ont été élucidées. À travers l’exemple des variations du métabolisme des médicaments, cette revue définit les objectifs de la pharmacogénétique, les bases moléculaires des variations interindividuelles de réponse aux médicaments et les méthodes qui permettent de déterminer ou de prédire si un sujet présente un risque particulier d’inefficacité ou de toxicité vis-à-vis de médicaments. Des exemples d’applications cliniques permettent d’illustrer l’intérêt de ces tests pharmacogénétiques pour la prise en charge thérapeutique des patients. La validation clinique d’un grand nombre de tests pharmacogénétiques et la mise au point de nouvelles technologies très performantes de génotypage devraient rapidement contribuer à un développement accru de la pharmacogénétique dans la pratique médicale courante, avec la perspective d’une individualisation des traitements médicamenteux.

Summary

Interindividual variability in drug responses can complicate patient management. This variability is partly due to genetic factors that affect pharmacokinetic and pharmacodynamic behavior. Pharmacogenetics is a discipline focusing on the molecular mechanisms underlying drug responses. Its overriding goal is to optimize drug treatments, in terms of both their efficacy and their safety. Polymorphisms of genes that encode drug-metabolizing enzymes, transporter molecules and receptors have a well-documented impact on the distribution and effects of many medications. This review examines the scope of pharmacogenetics, the molecular bases of interindividual variations in drug responses, and the methods used to assess the individual risk of drug failure or toxicity. Pharmacogenetic approaches have already entered the clinical arena, resulting in significant improvements in patient management. Clinical validation of new pharmacogenetic tests and the development of new efficient genotyping technologies should rapidly lead to patient-tailored therapy.

INTRODUCTION

Les réponses aux médicaments peuvent être différentes d’un patient à un autre aussi bien sur le plan de l’efficacité thérapeutique, qu’au niveau des effets indésirables.

Cette variabilité peut être une limitation à l’utilisation de certains médicaments, puisqu’elle est difficile à prévoir. En 1998, Lazarou et coll ., estimaient que les effets nocifs des médicaments étaient responsables de plus de 100 000 décès aux EtatsUnis (quatrième rang des causes de mortalité) et que le coût annuel dû aux hospitalisations et aux arrêts de travail était d’environ cent milliards de dollars [1].

En 2000, Pouyanne et coll . rapportaient que l’incidence des hospitalisations due à un effet indésirable de médicament était de l’ordre de 3,2 %, en France [2]. Ces études démontrent que les différences de réponse aux médicaments sont un problème médical et de santé public important.

À l’exclusion des erreurs d’indication, de posologie ou d’utilisation des médicaments, qui pour une grande part peuvent expliquer leur inefficacité ou leur toxicité, la variabilité de réponse aux médicaments peut aussi avoir une origine physiologique (âge, grossesse), pathologique (hépatopathie, atteinte rénale, pathologies associées), environnementale (alimentation, tabagisme, co-administration de médicaments), ou génétique (variations dans le métabolisme, le transport du médicament ou au niveau des récepteurs).

La pharmacogénétique étudie les mécanismes d’origine génétique intervenant dans la variabilité interindividuelle de la réponse aux médicaments, et a pour but le développement de tests simples permettant d’identifier les individus à risque de telles anomalies de réponse. Dés la fin des années 1950, le caractère héréditaire de réponses anormales à certains traitements médicamenteux a pu être démontré. Les soldats américains d’origine africaine, étaient plus sujets à développer des anémies hémolytiques, après prise de primaquine (antipaludéen), que les soldats d’origine caucasienne. Dix pour cent de ces sujets présentaient un déficit en glucose
6-phosphate déshydrogénase [3]. De même, lors des traitements avec l’isoniazide, certains patients développaient une neuropathie périphérique, conséquence de l’existence de polymorphismes au niveau du gène de la N -acétyltransférase (NAT2) qui inactive l’isoniazide [4]. Par la suite de très nombreux exemples de réponses anormales aux médicaments, d’origine génétique ont été décrits [5-7], rendant évident la nécessité de prévoir et de prévenir leur apparition.

La plupart des médicaments sont métabolisés par les cytochromes P450 (CYP).

Bertz et Granneman, en 1997, avaient déjà montré que plus de 50 % des médicaments, dont le métabolisme était connu, étaient catabolisés par les cytochromes P450 [8]. Parmi les gènes de cytochromes P450, moins de dix interviennent dans la transformation des médicaments. Le CYP3A4 est le plus important (50 %), suivi par le CYP2D6 (20 %), CYP2C9 et le CYP2C19 (15 %). D’autres types enzymes sont également responsables de la métabolisation des médicaments, les flavine monooxygénases, les UDP-glucuronyltransférases et les sulfotransférases [8]. Les gènes codant pour ces enzymes ont été clonés, séquencés et de nombreuses études ont permis d’identifier et de caractériser des polymorphismes à leur niveau. De nombreux alléles ont été mis en évidence, leur caractérisation a ensuite permis d’expliquer des variations de réponse à des médicaments.

La pharmacogénique devrait tenir un rôle majeur dans le développement de nouveaux médicaments et elle s’avère déjà très utile pour individualiser la thérapeutique des patients.

Les polymorphismes de beaucoup d’enzymes du métabolisme des médicaments sont maintenant assez bien connus, il est d’ailleurs possible par des tests de génotypage de prédire le métabolisme d’un individu avec une assez grande précision, il a ainsi été possible de corréler génotype et efficacité de traitement et/ou effets indésirables des médicaments.

La pharmacogénétique trouve ainsi aujourd’hui une application dans le traitement par les médicaments antidépresseurs, les dérivés thiopuriniques ou l’isoniazide.

POLYMORPHISMES GENETIQUES

La qualité et la quantité des enzymes métabolisant les médicaments dépendent en grande partie de l’information portée par le gène qui les code. Ces gènes peuvent présenter des mutations (anomalies de séquences) : mutations ponctuelles ou SNP (single nucleotide polymorphism), délétions partielles ou totales, voire des duplications ou amplifications. Ces différentes versions du même gène définissent des allèles, chaque individu possédant deux versions alléliques d’un même gène, identiques ou différents, déterminant le génotype. Au sein de la population générale, l’existence de ces versions alléliques, donc de différents génotypes définissent un polymorphisme génétique. De plus, l’allèle le moins fréquent doit présenter une fréquence d’au moins un pour cent [9]. Les mutations portées par ces gènes sont à l’origine de variation d’expression et/ou d’activité des protéines, ce qui peut entraî-

TABLEAU I. Prévalence des phénotypes limité et ultrarapide d’enzymes de phases I et II en fonction de l’origine ethnique [11] % ML (% MUR) Caucasiens Asiatiques Africains/ Noirs-Américains Phase I CYP2A6 < 1 % 2-4 % 0,3 % CYP2C9 0,2-1 % 2-3 % nd CYP2C19 2-5 % 10-20 % 1-5 % CYP2D6 < 1 % 0-20 % 5-10 % 0,5-2,5 % (29 % Ethiopiens) (2-10 %) Phase II NAT2 40-60 % 10-20 % 50-90 % TPMT 0,3 % < 0,3 % < 0,3 % ML : métaboliseur lent ; MUR : métaboliseur ultrarapide ; CYP : cytochrome P450 ; NAT2 :

N-acétyltransférase de type 2 ; TPMT : thiopurine S-méthyltransférase ; nd : non déterminé.

ner une diminution, un déficit, une augmentation ou l’absence de la protéine enzymatique [5]. Les polymorphismes génétiques sont exprimés dans la population générale sous la forme de phénotypes métaboliques, définissant le plus souvent deux groupes de sujets : des métaboliseurs lents ou limités (activité enzymatique diminuée) et des métaboliseurs rapides ou extensifs (activité enzymatique normale). Pour certaines enzymes polymorphes, sont également mis en évidence des sujets métaboliseurs ultrarapides (activité enzymatique augmentée) ou intermédiaires (activité enzymatique réduite) [5]. La fréquence des différents phénotypes est variable dans la population en fonction de l’enzyme polymorphe, et en fonction de l’origine ethnique [10].

Le tableau I rapporte la prévalence des phénotypes limité et ultrarapide pour des enzymes de phases I et II, en fonction de l’origine ethnique [11].

De nombreux polymorphismes génétiques d’enzymes de phase I et II ont été identifiés [5-7]. L’un des plus connu est celui du CYP2D6, pour lequel plus de soixante dix allèles ont été décrits (http : //www.imm.ki.se/Cyalleles), une vingtaine sont non fonctionnels et donc responsables d’un déficit d’activité enzymatique. Les mutations caractérisées au niveau de ces allèles non fonctionnels sont de diverse nature, soit des microlésions (mutations non-sens, faux-sens, frameshift par petite délétion ou insertion, mutation affectant les sites consensus d’épissage), soit des macrolésions (délétions complètes du gène, amplifications géniques). Une délétion complète du gène est à l’origine d’un déficit complet d’activité, alors que des
amplifications (deux à treize copies du gène) correspondant au phénotype ultrarapide sont responsables d’une surexpression de la protéine.

Génotypage

Il est facile actuellement de prédire le phénotype des sujets, en mettant en œuvre des méthodes fondées sur l’identification des anomalies génétiques à l’origine de la variabilité d’expression et d’activité de l’enzyme étudiée. Les tests de génotypage demandent cependant au préalable des corrélations phénotype/génotype et l’analyse fonctionnelle des mutations dans des systèmes d’expression in vitro .

La technique de PCR ou réaction de polymérisation en chaîne est à la base des méthodes utilisées en routine. A partir d’un échantillon biologique : sang total, frottis buccal, racines de cheveux), l’ADN génomique du sujet est extrait et purifié.

La stratégie à adopter est fonction de la nature et du nombre de mutations à identifier pour obtenir un taux d’efficacité de prédiction du phénotype, le plus élevé possible. Elle tient compte du contexte clinique : cadre préventif avant l’administration d’un traitement chez des patients à risque ou cadre diagnostique pour expliquer des accidents iatrogènes ou une non réponse à un traitement et également selon l’origine ethnique des sujets.

Dans le cadre du CYP2D6 , plus de soixante-dix variants alléliques ont été mis en évidence. Dans les populations caucasiennes, il est possible d’identifier avec un taux d’efficacité de l’ordre de 95 % les sujets au phénotype limité, par l’identification des trois mutations ponctuelles les plus fréquentes caractéristiques des allèles CYP2D6*3 (2549Adel, décalage du cadre de lecture), CYP2D6* 4 (1846G>A, abolition du site accepteur d’épissage de l’intron 3) et

CYP2D6*6 (1707Tdel, décalage du cadre de lecture). Les individus sont soit homozygotes pour l’un de ces allèles, soit hétérozygotes composites pour deux de ces allèles [12]. Ces mutations peuvent être recherchées par des tests de type PCR-RFLP (restriction Fragment Length Polymorphism) ou PCR-digestion enzymatique (quand la mutation crée ou abolit un site de restriction), ou Allèle spécifique-PCR (utilisation d’amorces oligonucléotidiques complémentaires de la séquence normale ou mutée). En recherchant la délétion complète du gène CYP2D6 ( CYP2D6*5 ), on améliore le taux de prédiction du phénotype limité par identification des individus homozygotes pour cette délétion (0,4 %), pour cela l’amplification de fragments d’ADN de plusieurs kilobases (long-PCR) permet de rechercher cette délétion, cette méthode a supplanté la méthode de Southern blot, peu pratique en routine [12]. Cette méthode long-PCR permet aussi de prédire le phénotype ultrarapide par l’identification d’une duplication (deux copies du gène en tandem sur le même chromosome) ou d’une amplification génique (au moins trois copies du gène), pour les métaboliseurs ultrarapides.

Les techniques de PCR quantitative utilisant la technologie Taqman®, permettent également de déterminer le nombre de copies d’un gène, chez un sujet [13]. Ces différents tests sont utilisés pour le CYP2D6 pour déterminer le phénotype du patient avant administration de médicaments à efficacité et/ou toxicité liée au métabolisme du sujet. Les autres mutations inactivatrices du gène CYP2D6 peuvent
être repérées par des méthodes de criblage de gènes, comme la SSCP (single strand conformation polymorphism) [14], fondée sur la mise en évidence de propriétés électrophorétiques différentes entre une séquence normale et une séquence mutée, ceci conduit à la mise en évidence de nouveaux polymorphismes, permettant d’approcher un taux de prédiction du phénotype voisin de 100 %. Il est également possible de séquencer le gène. La détermination du phénotype par génotypage demande d’utiliser un grand nombre de tests. Les techniques, comme la chromatographie liquide en milieu dénaturant (dHPLC) ou la discrimination allélique en temps réel (Taqman® ou lightcycler®), ou encore les puces à ADN doivent permettre la réalisation de tests à grande échelle de l’ensemble des gènes impliqués dans les variations de réponse aux médicaments [11].

PHARMACOGÉNÉTIQUE ET APPLICATIONS CLINIQUES

De nombreux polymorphismes génétiques des enzymes, des transporteurs ou des récepteurs ont été identifiés (Tableau II), actuellement le nombre de tests utilisés en routine est à ce jour encore restreint. Ce manque apparent d’applications cliniques de la pharmacogénétique provient essentiellement du fait que peu d’études cliniques prospectives démontrant l’importance de ces différents polymorphismes génétiques dans l’efficacité et la toxicité des médicaments ont été menées jusqu’à présent. Les conséquences cliniques des polymorphismes génétiques, en particulier ceux affectant les enzymes du métabolisme et les transporteurs des médicaments sont en effet plus ou moins importantes et dépendent d’un certain nombre de facteurs : importance de la voie polymorphe dans l’élimination du médicament, administration du médicament sous forme active ou de pro-drogue, activité pharmacologique ou toxique des métabolites, index thérapeutique du médicament.

CYP2D6 et médicaments psychotropes

Le CYP2D6 métabolise plus d’une centaine de médicaments de classe thérapeutique différente (anti-arythmiques, β-bloquants, antidépresseurs, neuroleptiques, opiacés,..), soit environ 25 % des médicaments d’usage courant et d’intérêt thérapeutique important [12]. De maniére surprenante, et alors que le CYP2D6 a fait l’objet d’une recherche intensive, en particulier concernant les mécanismes mioléculaires à l’origine de son polymorphisme d’activité, il existe peu d’applications cliniques justifiant l’étude systématique du phénotype CYP2D6, bien que le rôle du polymorphisme génétique du CYP2D6 dans le développement d’effets indésirables ou dans l’absence de réponse thérapeutique a été démontré. Actuellement son rôle est surtout démontré en psychopharmacologie [15].

Des antidépresseurs tricycliques (nortryptyline, amitryptyline), d’autres antidépresseurs (miansérine, fluoxétine, paroxétine) ainsi que des antipsychotiques (halopéridol, rispéridone, perphénazine), ont un index thérapeutique étroit et sont métabolisés par le CYP2D6.

TABLEAU II. Polymorphismes génétiques affectant la réponse aux médicaments [11] Gène

Médicaments-substrats

Conséquences cliniques liées au polymorphisme

Enzymes CYP2C9

Anticoagulants oraux Hémorragies Sulfamides hypoglycémiants Hypoglycémie CYP2C19 Oméprazole Efficacité augmentée chez les ML CYP2D6 Antidépresseurs tricycliques Inéfficacité chez les MURToxicité chez les ML Codéine Absence d’analgésie chez les ML DPD 5-fluorouracile Neurotoxicité NAT2 Isoniazide Neurotoxicité TPMT Azathioprine, mercaptopu- Hématotoxicité, myélosuppression rine, thioguanine Hématotoxicité, Myélosuppression UGT1A1 Irinotécan Diarrhée, neutropénie Transporteurs MDR1

Digoxine, antirétroviraux Biodisponibilité et efficacité variables Récepteurs, cibles , autres ACE

IEC (enalapril, captopril) Intensité, durée de l’effet ADRB2 Agonistes β2 (salbutamol) Bronchodilation variable, effets cardiovasculaires ALOX5 Zileuton Inefficacité thérapeutique DRD2,3 et 4 Antipsychotiques (clozapine, Efficacité variable halopéridol) agranulocytose G6PD Primaquine, sulfapyridine Anémies hémolytiques aiguës HERG Quinidine Syndrome de Long QT Cisapride Torsades de pointes HTR2A clozapine Efficacité variable KCNQ1 Terfénadine, disopyramide, Syndrome de Long QT méfloquine RYR1 Anesthésiques volatils halogé- Hyperthermie maligne nés, succinylcholine ML : métaboliseur lent ; MUR : métaboliseur ultrarapide ; CYP : cytochromes P450 ; DPD :

dihydropyrimidine déshydrogénase ; NAT2 : N-acétyltransférase 2 ; TPMT : thiopurine S-méthyltransférase ; UGT uridine glucuronosyltransférase ; MDR1 : multi-drug resistance (ou

ABCA1) ; ACE : enzyme de conversion de l’angiotensine 1 ; IEC : inhibiteurs de l’enzyme de conversion ; ADRB2 : récepteur β2 adrénergique ; DRD2, 3 et 4 : récepteurs dopaminergiques D2, D3 et D4 ; HERG, KCNQ1 : canaux potassiques ; HTR2A : récepteur sérotoninergique 5HT-2A ;

G6PD : glucose 6-phosphate déshydrogénase ; RUR1 : récepteur à la ryanodine.

Environ 30 à 40 % des patients dépressifs ne répondent pas suffisamment à leur thérapeutique. Il faut environ 1 mois pour identifier les sujets non-répondeurs [16], avec comme conséquence un traitement prolongé et une augmentation des coûts de santé. D’autres patients peuvent au contraire présenter des effets indésirables. Ces différences n’ont pas d’explication claire, mais les différences interindividuelles dans la pharmacodynamie et la pharmacocinétique des antidépresseurs tricycliques peuvent en partie expliquer cette variabilité. Hammer et Sjöqvist ont montré que des patients recevant des doses identiques de nortryptiline présentaient des concentrations plasmatiques très différentes [17], pouvant varier d’un facteur 30 à 40, à cause des différences entre les individus au niveau du métabolisme de ce médicament.

7 à 10 % des sujets caucasiens n’ont pas d’activité enzymatique CYP2D6 et sont classés comme métaboliseurs limités. Ces sujets sont homozygotes pour un des alléles non fonctionnel du CYP2D6 , ou portent une combinaison d’alléles non fonctionnels. Actuellement un peu plus de quinze allèles non fonctionnels ont été mis en évidence, la plupart d’entre eux sont extrémement rares, les deux plus fréquents sont le CYP2D6*4 et CYP2D6*5 Il existe également une variabilité interethnique dans l’activité CYP2D6, l’activité enzymatique étant réduite dans les populations asiatiques et négroides, comparées à la population caucasienne [7]. D’autres alléles ont été décrits, pour ceux-ci, l’activité enzymatique est plus faible, les sujets homozygotes pour ce type d’alléles ou ceux qui sont hétérozygotes pour un alléle non fonctionnel ont un phénotype ‘‘ métaboliseur intermédiaire ’’ [7]. Deux à dix % de la population caucasienne sont des métaboliseurs ultrarapides, conséquence d’une duplication du gène CYP2D6, conduisant à une activité enzymatique élevée in vivo [18], treize copies du gène CYP2D6 ont été mis en évidence dans une même famille [18].

La plupart des antidépresseurs tricycliques sont métabolisés par le CYP2D6, pour beaucoup de patients, selon leur phénotype, il est constaté des différences pharmacocinétiques. Des corrélations entre concentrations plasmatiques d’antidépresseurs tricycliques et effets cliniques ont pu être démontrées, cela reste compliqué car certains métabolites sont pharmacologiquements actifs. Un suivi thérapeutique de ces médicaments est conseillé chez les patients qui ne répondent pas au traitement ou chez ceux qui présentent des effets indésirables [19]. Chen et coll . ont montré que la fréquence des alléles non fonctionnels était deux fois plus élevée chez les individus présentant des effets indésirables, comparée à un groupe randomisé de sujets dépressifs [20].

Il a été rapporté une inefficacité thérapeutique chez les individus ‘‘ métaboliseurs ultrarapides ’’ (porteurs au moins de trois copies du gène), quand ils étaient traités par des doses conventionnelles d’antidépresseurs [12, 15, 21]. Ainsi des adaptations posologiques sont proposées par des auteurs qui recommandent des doses pouvant aller de 50 % (métaboliseurs lents) à plus de 200 % (métaboliseurs ultrarapides), de la dose usuelle [22]. Kirchheiner et Coll préconisent des recommandations pour la posologie d’une trentaine d’antidépresseurs en fonction non seulement du phénotype CYP2D6 mais également en prenant en compte le phénotype 2C19 [22].

Actuellement divers tests de génotypage permettent d’identifier les anomalies de
séquence du gène CYP2D6 et certains réarrangements du locus CYP2D (délétion, duplication ou amplification du gène) [12]. Le phénotype lent (7 à 10 % des Caucasiens) est ainsi prédit par ces tests avec un taux d’efficacité voisin de 100 %. La mise en évidence des variants alléliques CYP2D6*9, *10, *41, codant pour une enzyme à activité réduite ou affectant l’expression de l’enzyme permet de prédire les individus au phénotype intermédiaire (10 à 15 % des Caucasiens) [12]. Par contre, bien que le génotypage s’avère efficace pour l’identification des individus porteurs d’au moins trois copies d’un gène CYP2D6 fonctionnel, il ne permet d’identifier qu’environ 20 % des sujets au métabolisme ultrarapide (1 à 10 % des Caucasiens), d’autres mécanismes moléculaires à l’origine de ce phénotype restant à identifier. Dans ce dernier cas, le phénotypage, utilisant l’administration d’un substrat-test est une méthode de choix pour identifier les sujets métaboliseurs ultrarapides. Les cliniciens, en particulier les psychiatres peuvent avoir recours à l’adaptation de posologie individuelle pour les traitements psychotropes, au vu ou non de l’amélioration de l’état clinique des patients, en fonction des concentrations plasmatiques du médicament ou de ses métabolites mesurés dans le cadre du suivi thérapeutique. La détermination du phénotype CYP2D6 en cas d’anomalies de réponse à un traitement antidépresseur ou avant l’administration d’un tel traitement permettrait d’améliorer l’utilisation et la sécurité d’emploi de ces médicaments. Elle permettrait également de réduire les délais de réponse (plusieurs semaines, voire plusieurs mois) de ces psychotropes, par optimisation des doses de départ et d’entretien en fonction des capacités métaboliques des sujets.

TPMT et médicaments thiopuriniques

Le traitement anticancéreux est un domaine dans lequel les polymorphismes de enzymes du métabolisme ont des implications cliniques importantes. Les médicaments anticancéreux ont souvent un index thérapeutique étroit, ils sont administrés à des patients ayant des pathologies graves, telles que des leucémies lymphoblastiques chez l’enfant. Le recours aux tests de génotypage chez les patients présentant une toxicité sévère ou une absence de réponse de la tumeur pourrait les identifier, permettant un changement de traitement.

Les médicaments thiopuriniques, la 6-mercaptopurine (Purinéthol®) et la 6-thioguanine (Lanvis®) sont utilisés dans le traitement de certaines leucémies (leucémie aiguë lymphoblastique infantile) pour leurs propriétés cytotoxiques, l’azathioprine (Imurel®) (métabolisée en 6-mercaptopurine) est prescrite dans la prévention des rejets de greffe d’organe et le traitement des maladies autoimmunes et inflammatoires chroniques (maladie de Crohn et polyarthrite rhumatoïde). Pour être actives, ces substances doivent être transformées en nucléotides thioguanine, composés qui seront incorporés dans l’ADN. Ces médicaments sont métabolisés par la thiopurine S-méthyltransférase (TPMT), au niveau de la fonction thiol par méthylation au moyen de la S-adénosyl méthionine, donneur de méthyl. La méthylation évite la formation d’une trop grande quantité de nucléotides à thioguanine cytotoxiques, formés par la voie de l’hypoxanthine phosphoribosyltransférase [23],
car il existe, à cause de l’accumulation dans les tissus hématopoïétiques des métabolites actifs cytotoxiques un risque important de toxicité hématologique (leucopé- nie, thrombopénie, aplasie médullaire), après administration de ces molécules. Le risque d’hématotoxicité est dose dépendant et est élevé chez les patients ayant un déficit d’activité pour la thiopurine S-méthyltransférase (TPMT) qui inactive les thiopurines [23]. Dans la population caucasienne, 90 % des individus présentent une activité TPMT élevée (phénotype méthyleur rapide), 10 % ont une activité intermé- diaire (méthyleur intermédiaire) et 0,3 % ont un déficit d’activité (méthyleur lent) [24].

Une dizaine d’allèles non fonctionnels du gène de la TPMT ont été caractérisés [23].

Le gènotypage des mutations 238G>C, 460A>G et 719A>G, caractéristiques des allèles TPMT*2, *3A, *3B et *3C permet de prédire le phénotype des sujets avec un taux d’efficacité d’environ 95 % et ainsi d’identifier les patients à risque d’hématotoxicité avant l’introduction d’un traitement thiopurinique. Chez les patients déficitaires (porteurs de deux allèles mutants), une adaptation de la posologie est recommandée, par diminution de 5-15 % des doses usuelles [25]. Les patients au phénotype intermédiaire doivent être surveillés, car ils ont aussi un risque potentiel de toxicité hématologique [25-26]. Relling et coll. préconisent par contre d’augmenter les doses de ces médicaments chez certains patients métaboliseurs rapides [26]. Il a également été constaté des rejets de greffes [27] et des échappements thérapeutiques avec rechute chez des enfants leucémiques et chez les patients présentant une activité TPMT très élevée, donc sous-dosés en médicaments thiopuriniques (concentrations en thioguanine nucléotides inefficaces). La détermination du génotype TPMT ne permet pas d’identifier a priori ces sujets au métabolisme très rapide.

Pour ces derniers, il est conseillé de les repérer en réalisant la mesure de l’activité TPMT par phénotypage un mois après l’initiation du traitement [27]. Le polymorphisme génétique de la TPMT ne permet aujourd’hui que d’expliquer un tiers des cas de myelosuppression sous traitement par les thiopurines (d’autres facteurs génétiques ou non, en cours d’identification, existent probablement), il représente à ce jour l’un des meilleurs exemples de l’apport des tests pharmacogénétiques dans le cadre de l’aide à la thérapeutique, non seulement d’un point de vue purement clinique, mais également d’un point de vue économique [11].

N-acétyltransférase

Il existe deux isoformes de la N-acétyltransférase, la NAT1 et la NAT2. Le gène NAT2 présente un polymorphisme important, beaucoup de sujets, acétyleurs lents sont incapables d’acétyler des médicaments comme l’isoniazide, la sulphamethoxazole ou la caféine. Différents polymorphismes sont dus à des substitutions d’acides aminés dans la NAT2, ce qui conduit à une absence d’activité enzymatique in vitro .

La recherche de trois variants alléliques NAT2*5, NAT2*6 et NAT2*7 permet de détecter la majorité des acétyleurs lents au sein de la population caucasienne, bien que d’autres variants alléliques sont également fréquents dans d’autres groupes ethniques. Le pourcentage précis d’acétyleurs lents varie avec l’origine ethnique,
allant de 90 % chez les sujets d’Afrique du nord à moins de 10 % dans le monde asiatique, avec une fréquence de 50 % dans la population caucasienne [6].

L’isoniazide reste une substance importante dans le traitement de la tuberculose et la sulphamethazole est utilisée dans le traitement des infections secondaires chez les patients atteints de SIDA.

Pour l’isoniazide, les sujets acétyleurs rapides ont pu être différenciés des sujets acétyleurs lents par des tests de phénotypage, en utilisant des substrats comme l’isoniazide ou la caféine. Par la suite des tests de génotypage ont permis de caractériser 36 allèles (http : //www.louisville.edu/medschool/pharmacology/ NAT2.html). Les sujets acétyleurs rapides sont porteurs de un (acétyleur intermé- diaire), ou deux allèles fonctionnels (NAT2*4 et NAT2*12), les sujets acétyleurs lents sont porteurs de variants alléliques non fonctionnels.

Des études réalisées chez des volontaires sains ou des patients atteints de tuberculose ont montré l’élimination polymorphe de l’isoniazide avec des demi-vies de 80 minutes chez les acétyleurs rapides et de 180 minutes chez les acétyleurs lents [28].

Pour distinguer les différents types d’acétyleurs, rapides, intermédiaires et lents, les concentrations plasmatiques d’isoniazide et de son métabolite l’acétylisoniazide doivent de préférence être mesurées trois heures après l’absorption d’une dose standard de 5 mg d’isoniazide [29].

D’autres études démontrent que non seulement les concentrations, mais également l’efficacité et la toxicité de l’isoniazide sont liées à l’activité de l’enzyme NAT2. Les acétyleurs rapides ont une efficacité de l’isoniazide plus faible que les acétyleurs lents, après une semaine de traitement (85 % et 100 % de répondeurs au traitement, respectivement) [30].

Il est également démontré que les acétyleurs lents présentent plus souvent des neuropathies au cours du traitement par l’isoniazide, si la pyridoxine n’est pas coadministrée. Les acétyleurs lents ont également un risque plus élevé d’hépatotoxicité que les acétyleurs rapides [31]. L’association entre les génotypes de la NAT2 et des atteintes hépatiques sévères a été démontré chez des patients japonais atteints de tuberculose et traités par des doses standards d’isoniazide, en association avec la rifampicine [32]. Une association significative a été observée entre l’hépatotoxicité et le génotype NAT2 : comparé avec le type rapide, le risque était de quatre pour le type intermédiaire et de vingt-huit pour le type acétyleur lent [32]. Les auteurs suggé- raient de déterminer le génotype avant l’administration du traitement pour prédire les effets indésirables.

Kinzig-Schippers et coll. , en 2005 ont clairement démontré dans une population de sujets acétyleurs rapides, intermédiaires et lents, des différences dans les paramètres pharmacocinétiques de l’isoniazide (demi vie, aire sous la courbe, t , C ). Les max max sujets acétyleurs rapides porteurs du génotype NAT2*4/*4 avaient les plus basses concentrations en isoniazide, comparés aux sujets, présentant d’autres génotypes. Il y avait une différence évidente dans les concentrations plasmatiques en fonction du nombre d’allèles présentant une activité élevée NAT2*4. Chez les patients traités, le
nombre d’allèles de haute activité expliquait 88 % de la variabilité, alors que la forme galénique et le poids corporel comptaient pour 2 et 3 % de cette variabilité, respectivement, le sexe n’ayant pas d’effet significatif [33]. La dose recommandée d’isoniazide est de 5 mg/Kg. Cette dose est semble être un bon compromis pour tous les génotypes, et la plus appropriée pour les sujets porteurs d’un allèle de haute activité. Les résultats de Kinzig-Schippers et coll. montrent que les doses pourraient être ajustés à 2,5 ; 5 et 7,5 mg/Kg pour les sujets porteurs avec aucun, un ou deux allèles rapides NAT2, respectivement [33]. Ceci devrait permettre d’augmenter l’efficacité et la sécurité de ce médicament, ce qui éviterait des overdoses d’isoniazide chez les sujets acétyleurs lents. Cependant des essais cliniques prospectifs doivent encore être réalisés pour démontrer les mérites du génotype de la NAT2 et l’ajustement des doses dans le traitement à l’isoniazide.

Autres polymorphismes

Pour les cytochromes P450, des variants alléliques importants ont été décrits pour les CYP2C9 et 2C19. Le CYP 2C9 est responsable du métabolisme de la S-warfarine. Le CYP2C19 métabolise, la méphénytoïne, le diazepam et l’oméprazole.

La P-glycoprotéine est une protéine membranaire de transport, dont la surexpression est associée à la résistance tumorale à des anticancéreux (multidrug resistance ou MDR). Ses substrats médicaments sont des immunosuppresseurs, des hormones stéroïdiennes, des inhibiteurs calciques, des antiprotéases. Cette protéine, exprimée dans de nombreux organes joue un rôle dans l’absorption des médicaments, dans leur répartition dans les compartiments cellulaires et intervient donc dans la réponse de l’organisme aux médicaments. Un mutation 3435 C>T de l’exon 26 du gène de MDR1, codant pour la P-gp a été mise en évidence. Ce polymorphisme génétique est relié à une diminution d’expression de la P-gp et donc à son activité [34]. Trois génotypes ont ainsi été identifiés : homozygotes sauvages CC, Hétérozygotes CT, et homozygotes déficients TT.

Dans le cadre des traitements immunosuppresseurs par la ciclosporine ou le tacrolimus, substrats de la P-gp, il a été démontré chez les insuffisants rénaux une modification de la pharmacocinétique et notamment de la clairance orale de la ciclosporine, qui est augmentée chez les individus homozygotes TT. Pour le tacrolimus, il a également été démontré que la posologie nécessaire pour obtenir une concentration thérapeutique efficace, un mois après transplantation était corrélée au polymorphisme MDR1. Le génotypage MDR1 est un facteur prédictif de la dose initiale de tacrolimus, avec une réduction de 40 % de la posologie, chez les patients homozygotes TT [35].

Il existe également d’autres polymorphismes qui peuvent expliquer l’action des médicaments au niveau de leurs récepteurs (Tableau II) [11], en terme d’inefficacité thérapeutique ou de toxicité.

CONCLUSIONS

De nombreuses anomalies génétiques, à l’origine de variations d’expression et/ou d’activité de protéines impliquées dans la réponse de l’organisme à un médicament ont été identifiées. Des tests simples et peu coûteux ont été développés et ainsi permettent d’identifier les individus à risque de présenter des anomalies de réponse aux médicaments. La pharmacogénétique se révèle être une discipline prometteuse dans le pratique quotidienne de la médecine et permet d’offrir aux médecins la possibilité d’adapter les traitements médicamenteux (posologie), en fonction du statut génétique du patient.

L’individualisation des traitements devrait permettre d’améliorer l’efficacité des traitements et de diminuer les effets indésirables. Ceci devrait avoir aussi une importance en terme d’économie de santé, en réduisant l’incidence des hospitalisations due à l’iatrogénicité médicamenteuse. La prescription thérapeutique individuelle sur la base des facteurs génétiques peut être envisagée grâce aux progrès dans la connaissance des conséquences fonctionnelles des SNP, dans le développement de techniques performantes (rapides et peu coûteuses) de génotypage à ‘‘ haut débit ’’.

Cependant un certain nombre d’études restent à effectuer avant de passer à cette application clinique, en effet, jusqu’à maintenant, ces phénomènes pharmacogéné- tiques sont issus d’observations cliniques se rapportant à un petit nombre de sujets.

Des études cliniques prospectives sur de très grandes populations doivent être initiées pour démontrer que les polymorphismes sont importants pour prédire l’efficacité et la toxicité des médicaments, mais aussi pour montrer le bénéfice de ces tests pharmacogénétiques en terme d’économie de santé. Les études devront porter sur le métabolisme, le transport, mais aussi sur les récepteurs des médicaments.

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DISCUSSION

M. Bernard LAUNOIS

L’Azathioprine est un vieil immunosuppresseur. On est étonné qu’il y ait eu un accident mortel car il s’agit d’un médicament ancien, peu efficace. S’agit-il d’expérience ancienne ou récente ?

Le cas présenté était tiré de la publication

Gummert et coll . en 1995 : quelques jours après administration d’azathioprine, le patient présentait une sévère leucopénie. L’activité S -thiopurine méthyltransferase (TPMT) était mesurée et se situait sous les limites de détection de la méthode (enzyme inactive). Le patient décédait plusieurs semaines suite à une toxicité hématologique. Les auteurs conseillaient de réaliser une mesure de l’activité TPMT chez les sujets sous azathioprine, présentant une leucopénie. En cas d’activité faible la posologie du médicament devait être ajustée en fonction de l’activité de l’enzyme. Actuellement des médicaments thiopuriniques sont prescrits pour leurs propriétés cytotoxiques (Purinéthol®) dans le traitement de certaines leucémies, pour leurs propriétés immunosupressives (Imurel®) dans la prévention du rejet de greffe et dans le traitement de maladies inflammatoire chronique comme la maladie de Crohn et la polyarthrite rhumatoïde. Ces médicaments possèdent un risque important de toxicité
hématologique (leucopénie, thrombopénie, plus rarement aplasie médullaire parfois fatale), due à l’accumulation dans les tissus hématopoïétiques de métabolites actifs cytotoxiques de ces molécules. Aujourd’hui, il est possible, par des méthodes de génotypage d’identifier les individus à risque. Le génotypage des trois mutations les plus fréquentes (expliquant un déficit d’activité TPMT) permet de prédire le phénotype des individus avec un taux d’efficacité d’environ 95 % et ainsi d’identifier les individus à risque d’hématotoxicité avant l’introduction d’un traitement thérapeutique.

ANNEXE I

Exemples d’applications cliniques.

La réponse aux médicaments est souvent variable d’un patient à l’autre. Elle peut être estimée par le suivi thérapeutique du médicament, des tests de phénotypage utilisant des substrats ou médicaments-tests, ou des tests de génotypage.

Suivi thérapeutique

Le suivi thérapeutique permet d’obtenir une concentration plasmatique chez un patient, permettant d’apprécier la compliance et d’ajuster la posologie. La mesure doit être effectuée quand l’équilibre des concentrations ‘‘ steady-state ’’ est atteint. Il est nécessaire de disposer d’une méthode de dosage du médicament.

Phénotypage

Le phénotypage est principalement applicable dans le domaine des polymorphismes affectant la biodisponibilité des médicaments, et en particulier leur métabolisme. Les méthodes de phénotypage reposent sur une mesure directe de l’activité enzymatique ou, le plus souvent, sur l’administration d’un substrat-test (en général un médicament), suivie d’une mesure des quantités de substrat résiduelles et/ou de leurs métabolites.

Plusieurs heures après l’absorption d’une dose sub-thérapeutique du médicament-test (le temps est fonction de la pharmacocinétique de celui-ci), un échantillon biologique, urinaire ou sanguin le plus souvent, est recueilli et une quantification du substrat et de son (ses) métabolite(s) est réalisée à l’aide des méthodes chromatographiques essentiellement. Dans le cas le plus général, on détermine le rapport métabolique entre la quantité de substances retrouvée sous forme inchangée et celle d’un (ou plusieurs) métabolite(s), ce rapport étant le reflet de l’activité enzymatique étudiée. La valeur du rapport métabolique permet de classer les individus en métaboliseurs extensifs ou limités par comparaison à celle de l’antimode de distribution déterminée au préalable (de façon statistique) sur une grande population d’individus.

Lorsque l’administration directe du médicament n’est pas envisageable (médicaments immunosuppresseurs potentiellement toxiques), ces tests de phénotypage in vivo peuvent être remplacés par des tests ex vivo , comme dans le cas de la thiopurine S -méthyltransférase, dont la mesure d’activité est réalisée à partir d’un lysat érythrocytaire. En
fait, cette approche par mesure directe de l’activité enzymatique sur un tissu facilement accessible comme les érythrocytes ou les leucocytes serait préférable à la méthode par administration d’un médicament-test. Malheureusement, la grande majorité des enzymes présentant un intérêt en pharmacogénétique est peu ou pas exprimée dans ces tissus.

Les méthodes de phénotypage possèdent un certain nombre d’inconvénients, limitant leur utilisation en routine. L’application du protocole lui-même reste difficile et nécessite la compliance des patients. L’absence de substrat-test spécifique ou la survenue d’effets indésirables liée à son administration, la difficulté à interpréter la valeur du rapport métabolique en cas de co-administration de médicaments (interactions médicamenteuses) ou chez un individu les fonctions hépatiques et rénales altérées, sont autant de limitations à l’utilisation de ces tests.

Génotypage

Pour pallier ces inconvénients, des méthodes de génotypage permettant la prédiction du phénotype des individus ont été développées. Ces méthodes sont basées sur l’identification directe des anomalies génétiques à l’origine de la variabilité d’expression ou d’activité de l’enzyme étudiée. Des études de corrélation phénotype/génotype, complétées parfois par l’analyse fonctionnelle des mutations à l’aide de systèmes d’expression in vitro , sont généralement un préalable nécessaire au développement de ces tests de génotypage. En fait le génotypage est désormais plus largement utilisé en pharmacogé- nétique que le phénotypage, puisqu’il est applicable à l’analyse de l’ensemble des polymorphismes affectant non seulement la pharmacocinétique des médicaments, mais également leurs effets (récepteurs, cibles cellulaires). Des exemples décrits dans la litté- rature permettent de montrer l’intérêt des tests de génotypage.

Génotypage du cytochrome P-4502D6

En 2000, Sallée et coll . [1] rapportent le cas d’un enfant caucasien, décédé suite à un traitement médicament. A l’age de cinq ans cet enfant présentait des troubles du comportement, il était agressif et impulsif Il nécessitait une surveillance constante pour sa sécurité. Une encéphalopathie secondaire à un syndrome d’alcoolisme fœtal a alors été diagnostiquée, ainsi qu’un trouble de l’attention avec hyperactivité et un syndrome de Tourette. Il fut traité d’abord par de la clonidine. À l’age de six ans, en plus de la clonidine, lui fut prescrit de la fluoxétine pour un trouble obsessif et compulsif. En neuf mois de traitement la dose de fluoxétine était progressivement amenée à 30 mg/jour, provoquant vomissements et diarrhée, et nécessitant une hospitalisation. Malgré cet épisode, la clonidine et la fluoxétine lui furent à nouveau administrées, la dose de fluoxétine étant même augmentée à 40 mg/jour.

À huit ans, le patient était toujours traité par de la clonidine et de la fluoxétine, du méthylphénidate (60 mg/jour) fut ajouté au traitement ainsi que de la prométhazine. Le dosage en fluoxétine était alors de 80 mg/jour, il fit une crise convulsive généralisée dans les quatre mois. La dose de fluoxétine fut augmentée à 100 mg/jour.

À l’age de neuf ans, des crises d’épilepsie furent observées, puis le patient présenta un état de mal épileptique et fit un arrêt cardiaque. Le rapport médical concluait à une mort due à la toxicité de la fluoxétine, la mort pouvant être due à un homicide. Cette conclusion était liée au fait que l’enfant n’avait pas arrêté sa médication et montrait des signes de
toxicité, qui étaient corroborés par les concentrations sanguines et tissulaires de fluoxé- tine et de son métabolite principal le norfluoxétine). Dans le sang, les concentrations de fluoxétine et de son métabolite étaient égales et mesurées à 21 µg/mL. Une enquête fut diligentée contre les parents adoptifs.

Le génotypage, réalisé post mortem montrait que cet enfant était un métaboliseur limité pour le cytochrome P4502D6, les parents furent disculpés.

Génotypage de la thiopurine S -méthyltransférase.

L’azathioprine est associée en double ou triple thérapie immunosuppressive dans les transplantations cardiaques. En 1995, Gummert et coll . [2] rapportaient le cas d’un décès chez un patient de 65 ans ayant subi une greffe cardiaque. Le traitement du patient associait de la cyclosporine, de la prednisolone et de l’azathioprine. Plusieurs semaines après administration d’azathioprine, le patient développait une sévère leucopénie. L’activité de la thiopurine S-méthyltransférase (TPMT) était mesurée. Elle était sous la limite de détection de la méthode. Le patient décédait d’une septicémie. Les auteurs concluaient qu’il fallait déterminer l’activité TPMT chez les patients transplantés, présentant une leucopénie sous traitement par l’azathioprine. Ils conseillaient, si la TPMT était déficitaire d’ajuster la posologie de l’azathioprine ou de changer de traitement immunosuppresseur.

Actuellement les tests de génotypage permettent de prédire le phénotype des sujets avec un taux d’efficacité d’environ 95 % et d’identifier les patients à risque d’hématotoxicité avant la mise en place d’un traitement par l’azathioprine ou les substances thiopuriniques.

Génotypage de la N-acétyltransférase Type 2 (NAT2)

Récemment, Kinzing-Schippers et coll. [3] étudiaient le métabolisme de l’isoniazide dans une population de patients, pour laquelle, lest tests de génotypage ont été réalisés. 4 allèles ont été mis en évidence, permettant dans leur population de 18 sujets d’identifier 3 sujets acétyleurs rapides, deux sujets acétyleurs intermédiaires et treize sujets acétyleurs lents. Ils observaient que pour des doses administrées (100 mg ou 300 mg/ voie orale et 200 mg par voie intraveineuse), les concentrations mesurées d’isoniazide dans le plasma, par chromatographie liquide de haute performance, étaient beaucoup plus faibles pour les sujets acétyleurs rapides. La différence observée au niveau des concentrations plasmatiques se retrouvait au niveau des valeurs de l’aire sous la courbe et des valeurs de C . De plus, il existait une relation linéaire entre la clairance de l’isoniazide et le max nombre d’allèles fonctionnels. Les auteurs concluaient que le nombre des allèles fonctionnels de la NAT2 comptait pour 88 % de l’ensemble de la variabilité, la forme galénique et le poids du corps pour 2 % et 3 %, respectivement, tandis que le sexe n’avait pas d’effet. La posologie standard journalière de l’isoniazide chez l’adulte est de 5,0 mg/ kg. Cette dose représente la meilleure en terme de rapport bénéfice/risque pour tous les génotypes NAT2. Elle pourrait être la mieux appropriée pour les patients ayant un allèle fonctionnel. En fonction de leurs résultats, les auteurs préconisent d’ajuster la posologie à 2,5 mg, 5,0 mg et 7,5 mg pour les patients avec aucun, un ou deux allèle(s) fonctionnels.

Cependant des essais cliniques prospectifs devraient être réalisés pour montrer la possibilité d’ajuster la posologie en fonction du génotype NAT2.

En conclusion, le génotypage se réalise sur un seul échantillon sanguin, le résultat est valable tout le long de la vie du sujet, il aide à faire la différence entre non compliance et variabilité génétique de l’enzyme métabolisant le médicament, il n’est pas affecté par l’administration simultanée d’autres médicaments. Le génotypage est spécifique de mutations identifiées. Il prédit la capacité métabolique d’un individu. Cependant le phénotypage n’est pas sensible à 100 % (mutations non encore identifiées).

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[3] KINZIG-SCHIPPERS M., TOMALIK-SCHARTE D., JETTER A. et al. — Should we use

N6acetyltransferase type 2 genotyping to personalize isoniazid doses ?

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* EA 2679, Université de Lille 2 et Service de Toxicologie et Gènopathies, CHRU de Lille. Avenue du Pr. J. Leclercq, 59037 Lille Cedex. Tirés-à-part : Professeur Michel LHERMITTE, même adresse. Article reçu et accepté le 16 janvier 2006.

Bull. Acad. Natle Méd., 2006, 190, no 1, 55-73, séance du 3 janvier 2006