Communication scientifique
Séance du 6 février 2001

Intérêt du génotypage fœtal RHD dans la prévention de l’immunisation anti-D

MOTS-CLÉS : érythroblastose fœtale. génotype.. immunoglobuline rh. iso-immunisation rh
Importance of RHD fetal genotyping for preventing anti-D immunisation
KEY-WORDS : erythroblastosis, fetal. genotype.. rh isoimmunization. rho (d) immune globulin

Y. Brossard, A. Sender, J.P. Cartron, J. Huchet, F. Pinon, Ph. Blot, G. David

Résumé

L’immunoprophylaxie de l’immunisation fœto-maternelle Rhésus D par l’injection d’immunoglobulines anti-D est largement appliquée aux femmes Rh négatif, après l’accouchement d’un enfant Rh positif et après interruption de grossesse. La possibilité de pratiquer le groupage Rh du f œ tus par génotypage sur l’ADN des cellules amniotiques et surtout sur l’ADN fœtal du plasma maternel devrait permettre l’extension de la prévention à la période prénatale chez toutes les femmes porteuses d’un fœtus Rh positif. Ainsi améliorerait-on encore l’efficacité de l’immunoprophylaxie tout en limitant l’utilisation d’un produit, les gammaglobulines, d’origine humaine, aux seuls cas bien justifiés.

Summary

Anti-D prophylaxis is currently applied in France after birth of an RhD positive infant, after interruption of pregnancy and after some antenatal immunizing events (amniocentesis…). However this program does not cover all the prenatal exposures to fetal RhD antigen, and maternal Rh immunization continues to occur. DNA RhD genotyping of the fetus is now reliably performed on amniotic fluid, and pre diagnostic studies on fetal DNA extracted from maternal plasma are promising. The widespread use of fetal RhD genotyping on maternal blood would allow the antenatal administration of Rh immuneglobuline in all Rh * Centre d’Hémobiologie Périnatale (CHP), 53 Boulevard Diderot — 75570 Paris cedex 12. ** Unité INSERM U 76, Institut National de la Transfusion Sanguine. 6, rue Alexandre Cabanel — 75015 Paris. Tirés-à-part : Professeur Georges DAVID, à l’adresse ci-dessus. Article reçu le 12 janvier 2001, accepté le 15 janvier 2001. negative patients bearing an Rh positive fetus, insofar as it would preclude exposing the other Rh negative patients to the above plasma derived and rather expensive blood product

L’histoire de l’immunisation fœto-maternelle Rhésus a pour point de départ la découverte du système de groupe sanguin Rhésus, en 1940, par Landsteiner. En un demi-siècle on a assisté à l’identification de la maladie fœtale et néonatale qu’elle provoque, à la mise au point de son traitement postnatal par l’exsanguinotransfusion du nouveau-né, puis du traitement prénatal par transfusion fœtale in utero, enfin à sa prévention par l’injection de gammaglobulines.

Ainsi une génération médicale a vu se dérouler le cycle complet de cette maladie : sa découverte, sa compréhension, sa maîtrise thérapeutique puis sa prévention. Alors sa disparition est-elle proche ? Malheureusement pas. Car il ne s’agit pas d’une maladie infectieuse dont on peut espérer l’éradication de l’agent causal. C’est une affection qui relève de la génétique, puisqu’elle est inhérente à la combinaison constitutionnelle de certains couples. On ne peut espérer qu’en pallier les consé- quences par un effort de prévention qui devra être poursuivi inlassablement sous peine d’un retour de ses manifestations.

C’est sur les contraintes de cette prévention que nous insisterons aujourd’hui, ainsi que sur ses récents progrès. Mais avant de les aborder, il n’est pas inutile de rappeler le mécanisme de l’immunisation et de ses conséquences fœtales et néonatales.

PHYSIOPATHOLOGIE DE L’IMMUNISATION ET SES CONSÉQUENCES

Le système Rhésus

Classiquement on attribuait au système Rhésus 3 couples d’allèle : C et c, E et e, D et d reconnus (sauf d) par des anticorps spécifiques.

La récente découverte des gènes du système a clarifié cette vue [1]. Le phénotype dépend de deux gènes : le gène D et le gène CE, chacun codant pour un polypeptide de la membrane de l’hématie.

Le gène D est soit présent (sujet Rhésus positif), soit absent ou silencieux (sujet Rhésus négatif). Il présente également des réarrangements qui modulent son expression phénotypique. Le gène CE est polymorphe, le polypeptide exprimant soit C ou c, E ou e.

Le locus Rh est situé à l’extrémité du bras court du chromosome 1.

Mécanisme de l’immunisation

Dans les conditions actuelles, où les immunisations d’origine transfusionnelle sont en principe évitées, l’immunisation fœto-maternelle résulte du passage transplacen-
taire, fréquent pour ne pas dire habituel au moment de l’accouchement, d’hématies fœtales dans la circulation maternelle. Lorsque les hématies sont porteuses d’un antigène d’origine paternelle non présent chez la mère, elles déclenchent la fabrication d’allo-anticorps correspondants. L’immunisation de loin la plus fréquente est une immunisation anti-RhD.

Parmi les allo-anticorps produits par la mère, les immunoglobulines franchissent le placenta par un mécanisme actif de transcytose syncytiotrophoblastique. Ce transfert est précoce, dès le 3e mois de la grossesse. Son importance va en croissant de telle sorte que le taux fœtal atteint, voire dépasse, le taux maternel en fin de grossesse.

Chez le fœtus, les anticorps forment, en se fixant sur les antigènes Rhésus des hématies, des immuns complexes qui se lient aux récepteurs des macrophages, les activent et provoquent l’hémolyse.

Manifestations fœtales et néonatales

L’hémolyse comporte deux conséquences :

— la libération d’hémoglobine, transformée en biliverdine puis en bilirubine non conjuguée qui est épurée par le trophoblaste vers la circulation maternelle ;

— une anémie partiellement compensée par une réaction érythroblastique intense.

Au-dessous d’un certain seuil (environ 7g/dL au cours du deuxième trimestre et 9g/dL au cours du troisième trimestre) peut survenir une défaillance circulatoire avec constitution d’épanchements séreux et d’œdèmes tissulaires, y compris placentaires. C’est la classique anasarque fœto-placentaire aboutissant à la mort fœtale ou néonatale.

Dans les formes moins graves avec naissance d’un enfant vivant, l’anémie se poursuit. Mais une autre symptomatologie se développe, l’ictère. L’épuration de la bilirubine ne dispose plus du secours placentaire. D’autre part, l’épuration hépatique est inefficace du fait de l’immaturité de la glycuroconjugaison dans les premiers jours de la vie. L’hyperbilirubinémie provoque, au-delà d’un certain seuil (200 mg/L), une nouvelle menace, l’ictère nucléaire, ainsi dénommé du fait de la fixation toxique de la bilirubine sur les neurones des noyaux thalamiques, du tronc cérébral et du cervelet. Cette encéphalopathie bilirubinique laisse, en cas de survie, de graves séquelles motrices et sensorielles.

PRISE EN CHARGE THÉRAPEUTIQUE

Avant la naissance

L’immunisation maternelle est révélée par la présence d’anticorps lors des recherches d’agglutinines irrégulières, obligatoires au cours de la grossesse. En cas de
positivité, se pose alors le problème, plus difficile, de l’évaluation de l’atteinte fœtale.

Elle ne repose que sur des signes indirects, avant tout le titrage et la mesure pondérale des anticorps maternels. Mais, d’une part il n’y a pas un parallélisme étroit entre leur taux et la gravité de la maladie, d’autre part leur évolution au cours de la grossesse est variable et difficilement prévisible, ce qui impose des examens réguliers et rapprochés.

La détection de l’anémie fœtale ne peut être, également, qu’indirecte : soit par la mesure dans le liquide amniotique du taux de bilirubine, traduisant l’intensité de l’hémolyse, mais elle nécessite une amniocentèse qui n’est pas sans inconvénient, en particulier celui d’aggraver l‘immunisation ; soit par des signes de souffrance circulatoire décelés notamment par l’échographie, le rythme cardiaque et le doppler du flux sanguin, mais ces signes sont tardifs.

Les mesures thérapeutiques sont fonction de la gravité de l’anémie : transfusion ou même exsanguino-transfusion partielle in utero par ponction des vaisseaux ombilicaux et accouchement prématuré.

Après la naissance

Si l’anémie est immédiatement intense, elle nécessite une exsanguino-transfusion par concentré globulaire. Mais c’est la prévention de l’ictère nucléaire qui devient la préoccupation majeure. Elle est fondée sur une surveillance du taux de bilirubine (en distinguant la bilirubine totale et la bilirubine non liée à l’albumine qui représente la fraction neurotoxique). La règle est de maintenir le taux de bilirubine sous la limite des 200 mg/dL en combinant exsanguino-transfusion et photothérapie.

Cette phase difficile des 5 premiers jours passée, une anémie secondaire peut encore s’installer au cours des semaines suivantes.

PRÉVENTION PAR LES IMMUNOGLOBULINES ANTI-RHD

Mécanisme et efficacité de l’immunoprophylaxie

Les immunoglobilines empêchent l’immunisation secondaire à l’hémorragie fœtomaternelle par deux mécanismes :

— principalement par la destruction rapide de ces hématies selon le même mécanisme que chez le fœtus, — par l’inhibition des cellules B maternelles, incapables de se transformer en plasmocytes et de produire des anticorps.

Cet effet protecteur a été démontré par de nombreux essais thérapeutiques dès les années 70. Dans les séries traitées, après la première naissance d’un enfant Rhésus positif et ABO compatible (si l’enfant est ABO incompatible, les anticorps anti A et B exercent une certaine protection naturelle) la fréquence moyenne d’une immuni-
sation maternelle 6 mois après l’accouchement est seulement de 0,4 % contre 4 à 8 % dans les séries non traitées. Ce taux d’efficacité d’environ 90 % se confirme après la deuxième grossesse avec enfant Rhésus positif. Alors que le taux d’immunisation, chez les femmes non traitées, s’élève en moyenne à 12 %, il reste à 1,5 % chez les femmes traitées [2].

Ces premières études mirent également en évidence : d’une part la nécessité de faire l’apport d’anti-D dans un délai rapide après l’accouchement, moins de 72 heures ;

d’autre part l’importance du volume de l’hémorragie maternelle, qui conditionne fortement le risque d’induction d’une immunisation [3]. D’où l’importance, pour déterminer la quantité d’immunoglobulines à injecter, de faire une évaluation du volume d’hématies fœtales ayant pénétré dans la circulation maternelle. Ceci est possible grâce au test de Kleihauer, qui permet l’identification de ces hématies [4].

Indications actuelles

Les résultats très positifs de ces premières études furent à l’origine de la mise en pratique de l’immunoprophylaxie systématique chez toute femme Rhésus négatif après accouchement d’un enfant Rhésus positif, ce qui représente le chiffre considérable de 70 000 femmes par an, en France.

Par ailleurs on a étendu cette pratique au post abortum , qu’il s’agisse d’interruptions spontanées ou provoquées, et même en cours de grossesse en cas de traumatisme abdominal ou de toute autre circonstance susceptible de causer une hémorragie fœto-maternelle, y compris et surtout les amniocentèses. Là aussi le nombre de femmes concernées, chaque année, est important : 20 000 après avortement spontané, 20 000 après interruption volontaire de grossesse, 10 000 après amniocentèse, enfin 20 000 pour des causes diverses. C’est donc un total d’environ 160 000 femmes qui relèvent de ces indications chaque année.

Faut-il aller plus loin ?

Certains pays (États-Unis, Canada, Grande Bretagne) ont étendu cette immunoprophylaxie à la période prénatale en pratiquant une injection systématique au dernier trimestre de toute grossesse de femme Rh négatif non encore immunisée.

La justification de cette extension est fondée sur le fait qu’une immunisation peut se produire au cours même de la première grossesse, dans les deux derniers mois avant l’accouchement, du fait de passages d’hématies fœtales, minimes mais suffisants pour induire l’immunisation [5]. L’application de l’ensemble de ces mesures fait tomber la fréquence cumulée des immunisations maternelles après naissance du deuxième enfant Rhésus positif de son taux spontané, en moyenne 12 %, à environ 1 % [6].

Cette couverture maximale, en particulier l’injection systématique au cours de toute grossesse de femme Rhésus négatif a pour inconvénient certaines administrations inutiles puisqu’un certain pourcentage des fœtus (environ 40 %) est Rhésus négatif,
donc sans risque d’immunisation. La surconsommation d’un tel produit, outre son inconvénient économique (une majeure partie est importée des États-Unis où se pratiquent des immunisations délibérées de sujets Rh négatif, ce qui est proscrit en France) a surtout l’inconvénient d’augmenter les risques de contamination infectieuse que comporte potentiellement tout produit d’origine sanguine. En une période où l’on en vient à prendre en compte le risque de transmission du prion pathologique, ces craintes ne peuvent plus être négligées.

Aussi est-on resté réservé dans notre pays, spécialement marqué par le drame du sang contaminé, à l’égard d’une pratique allant jusqu’à des injections prénatales aveugles quant au groupe Rhésus du fœtus. Certes une technique pourrait permettre de connaître ce groupe. C’est un prélèvement sanguin fœtal au niveau des vaisseaux ombilicaux. Mais au prix de risques fœtaux disproportionnés et d’une cause d’hémorragie fœto-maternelle supplémentaire.

Deux découvertes sont venues, récemment, bouleverser le problème dans un sens heureux. Tout d’abord l’identification des gènes du système Rhésus permettant de passer de la détermination phénotypique classique, par les anticorps spécifiques des groupes exprimés sur les hématies, à une détermination génotypique sur l’ADN de toute cellule [1]. Ensuite la découverte de l’existence, au cours de la grossesse, non seulement de cellules fœtales mais d’ADN libre dans la circulation maternelle sur lequel peut être pratiqué le génotypage [7].

Dès lors s’ouvrait la possibilité d’une nouvelle approche pour l’identification du groupe Rhésus fœtal, se réduisant à une prise de sang maternel. C’est cette voie qu’a entrepris d’explorer le Centre d’Hémobiologie Prénatale en liaison avec l’Unité INSERM U 76, Institut National de la Transfusion Sanguine.

Détermination du groupe Rhésus fœtal par génotypage

La mise au point technique et la fiabilité ont tout d’abord été testées sur l’ADN fœtal extrait des cellules du liquide amniotique, qui sont d’origine fœtale [8]. L’étude a porté sur une série de 437 liquides amniotiques provenant d’amniocentèses faites pour différentes indications. Les résultats ont été comparés à ceux du groupage traditionnel des nouveau-nés. On a ainsi pu établir la sensibilité du génotypage, 100 %, et sa spécificité, 95 %. Ce léger défaut de spécificité ne tient pas au test lui-même, mais à l’existence connue de gènes D non fonctionnels : le gène existe, mais il ne s’exprime pas au niveau phénotypique. Heureusement la conséquence en est beaucoup moins grave que ne le serait un défaut de sensibilité. Une amélioration technique devrait permettre d’y remédier.

Ces résultats favorables ont fait considérer le génotypage comme validé. Il est maintenant, depuis octobre 1997, à la disposition de toutes les équipes obstétricales de la région parisienne qui peuvent y recourir chaque fois qu’elles ont à pratiquer une amniocentèse chez une femme Rh négatif, ce qui devient de plus en plus fréquent en raison de l’extension du dépistage des anomalies chromosomiques.

Par ailleurs l’objectif, plus important encore, d’un génotypage sur l’ADN fœtal du plasma maternel fait l’objet d’une étude en cours qui portera sur 1 000 femmes Rh négatif testées en début de grossesse. Les difficultés sont évidemment plus grandes que pour le liquide amniotique. Ceci pour deux raisons. Tout d’abord la quantité très réduite d’ADN fœtal dont on dispose. D’autre part la difficulté de trouver des marqueurs spécifiques de l’ADN fœtal par rapport à l’ADN maternel. Cependant les premiers résultats obtenus laissent espérer des solutions satisfaisantes.

Il n’est donc pas déraisonnable de miser sur une prochaine entrée en application pratique de cet important progrès.

Intérêt du génotypage Rhésus sur l’ADN fœtal du plasma maternel

L’intérêt majeur sera de permettre un meilleur ciblage de la prévention de l’immunisation maternelle par les gammaglobulines chez les femmes Rh négatif en cours de grossesse. Dès maintenant environ 30 % des femmes Rh négatif non immunisées reçoivent des injections anténatales d’immunoglobulines à la suite de circonstances spontanées ou de gestes obstétricaux susceptibles de provoquer une hémorragie fœto-maternelle. Faute de pouvoir identifier le groupe fœtal, ces injections sont faites indistinctement, quel que soit le groupe du fœtus. Or environ 40 % des fœtus sont Rh négatif, ne comportant donc aucun risque d’immunisation maternelle. Le ciblage de l’immunoprophylaxie anténatale que permettrait le groupage génotypique éviterait ces injections d’un produit rare, cher et dont l’origine sanguine humaine laisse toujours planer un doute quant à son innocuité.

Le ciblage permettrait, au demeurant, d’accepter une extension de l’immunoprophylaxie à toutes les femmes Rh négatif, en cours de grossesse, dès lors que le génotypage aurait révélé que le fœtus est Rh positif. On se rapprocherait ainsi de la pratique anglo-saxonne, mais avec l’énorme différence d’une limitation aux seuls cas justifiés.

Mais l’intérêt du génotypage fœtal débordera le champ de la prévention et concernera deux autres domaines.

Tout d’abord celui de la détection de l’immunisation maternelle qui repose sur des recherches itératives d’agglutinines irrégulières au cours de la grossesse des femmes Rh négatif (au moins 4 par grossesse). Limiter le renouvellement aux seules femmes enceintes d’un enfant Rh positif est un objectif médicalement rationnel et dont on pourrait démontrer l’intérêt économique.

Enfin, dans le domaine du suivi des femmes immunisées, il serait utile de pouvoir déterminer le plus tôt possible et d’une manière non invasive si le fœtus est Rh positif ou non. Dans ce dernier cas la surveillance serait allégée.

CONCLUSION

Bien que maîtrisée, l’immunisation fœto-maternelle restera toujours menaçante. Sa prévention par les gammaglobulines ne doit pas faire relâcher la vigilance. Malgré
toute la gratitude qu’on lui doit en raison de son efficacité il ne faut pas sous-estimer les risques potentiels de cette pratique.

En attendant l’apparition probable de produits à effet identique mais d’origine biotechnique, le génotypage Rh fœtal dans le liquide amniotique et plus encore dans le sang maternel nous donne le moyen d’une utilisation plus judicieuse des gammaglobulines.

REMERCIEMENTS

Nous remercions V. de Lachaux pour sa contribution à la présentation orale de cette note.

BIBLIOGRAPHIE [1] COLIN Y., CHERIF-ZAHAR B., LE VAN KIM C., RAYNAL V., VAN HUFFEL V., CARTRON J.P. — Genetic basis of the Rh D positive and Rh negative blood group polymorphisme as determined by Southern analysis. Blood , 1991, 78, 2747-2752.

[2] BROSSARD Y., PARNET-MATHIEU F., LARSEN M. — Incompatibilités fœto-maternelles érythrocytaires. Transfusion sanguine. Une approche sécuritaire. Lefrere J.J., Rouger P., John Libbey, 2000, 290-318.

[3] WOODROW J.C. — Rh immunisation and its prevention. Ser Haematol, 1970, 3, 3-12.

[4] KLEIHAUER E., BRAUN H., BETKE K. — Demonstration von Fetalem haemoglobin in den erythrocyten eines Blutausstrichs. Klin Wschr , 1957, 35, 637-638.

[5] HUCHET J., DEFOSSEZ Y., BROSSARD Y. — Detection of transplacental haemorrage during the last trimester of pregnancy. Transfusion , 1988, 28, 506.

[6] HUCHET J., DALLEMAGNE S., HUCHET C., BROSSARD Y., LARSEN M., PARNET-MATHIEU F. — L’utilisation antepartum de l’immunoglobuline anti-D chez la femme Rh négatif. J Gynecol Obstet Biol Reprod Paris, 1987, 16, 101-111.

[7] LO Y.M., HJELM N.M., FIDLER C., SARGENT I.L., MURPHY M., CHAMBERLAIN P., POON P., REDMAN C., WAINSCOAT J. — Prenatal diagnosis of fœtal Rh D status by molecular analysis of maternal plasma. N Engl J Med, 1998, 339, 1734-1738.

[8] AUBIN J.T., LE VAN KIM C., MOURO I., COLIN Y., BIGNOZZI C., BROSSARD Y. — Specificity and sensitivity of the Rh D genotyping methods by the PCR-based DNA amplification. Br J Haematol, 1997, 98, 356-364.

Bull. Acad. Natle Méd., 2001, 185, no 2, 329-336, séance du 6 février 2001