INTRODUCTION

L’apport de l’animal à la recherche pharmacologique comme à la connaissance de l’homme normal ou pathologique est d’une telle importance qu’il est difficile d’échapper à toute banalité lorsqu’on l’évoque.

Par exemple, pratiquement tous les prix Nobel de physiologie et de médecine ont eu recours à l’expérimentation animale. Ce fut le cas de Pasteur dont le vaccin contre la rage a d’abord été testé chez le chien. Il en est resté de même jusqu’à nos jours en passant par celui obtenu en 1913 par le Pr Richet pour ses travaux sur l’anaphylaxie.

Aujourd’hui, malgré les progrès de la simulation numérique, de l’informatique et de la modélisation force est de reconnaître qu’une pharmacologie totalement dépourvue d’expérimentation animale dite pharmacologie « in silico » reste chimérique.

Ceci est particulièrement vrai lorsqu’on s’adresse à des fonctions complexes qui sont assurées ou régulées à un haut niveau d’intégration. Ainsi, il devrait y avoir consensus pour admettre qu’il est difficile de prendre la pression artérielle d’une cellule en culture de même que d’apprécier le caractère plus ou moins dépressif d’organes isolés perfusés.

Toutefois une meilleure prise de conscience par les pharmacologues des contraintes infligées par eux à l’animal d’expérience ainsi que le très justifié respect de la règle des ‘‘3 R’’ a conduit à une aussi importante que souhaitable réduction du recours à l’animal d’expérience.

Ceci s’applique assez aisément à la partie la plus classique de l’expérimentation pharmacologique : celle qui concerne la mesure de l’intensité et de la durée des effets d’une famille de molécules candidates au statut de médicament. D’ailleurs si la cible moléculaire est bien définie, la comparaison des divers candidats peut même se faire in vitro . Mais, d’une manière générale, l’amélioration des modèles animaux conjuguée aux progrès techniques dans leur étude permet de réduire significativement et fort heureusement la contribution quantitative des animaux à cette phase de la recherche pharmacologique.

Il en est de même, mais à un degré moindre, dans la partie qui se situe en amont de cette pharmacologie classique. Celle-ci, plus proche de la physiologie porte sur l’analyse des mécanismes d’une pathologie reproduite par un modèle expérimental adapté. Bien menée et avec une bonne dose de chance cette étude physiopathologique peut conduire à identifier une nouvelle cible pharmacologique, voire à générer un nouveau concept thérapeutique.

Obtenir la preuve de la validité de ce concept nécessitera obligatoirement le recours à l’expérimentation animale. C’est donc dans ce cadre que sont brièvement présentés dans cet article trois exemples choisis parce qu’ils ont tous bénéficié de la contribution de membres d’une de nos compagnies et parce qu’ils illustrent que l’utilisation de l’animal, dans des conditions éthiques rigoureuses, peut contribuer de différentes façons au progrès pharmacologique : — une recherche fondamentale qui débouche sur une nouvelle classe thérapeutique ; — le développement d’un nouveau modèle expérimental qui permet de vérifier un concept thérapeutique innovant et une observation chez le gros animal qui permet de mieux comprendre une pathologie humaine et d’en envisager enfin le traitement.

Rôle vasodilatateur du monoxyde d’azote (NO)

En 1978, R. Furchgott (prix Nobel en 1998) [1] s’intéressait aux réponses de l’aorte de lapin aux médiateurs du système nerveux végétatif. Sujet banal, d’intérêt a priori assez limité.

Dans ses premiers travaux il utilise des bandelettes hélicoïdales d’aortes soigneusement disséquées et constate que l’acétylcholine (Ach) est toujours vasoconstrictrice.

Puis il délaisse les bandelettes pour des anneaux d’aorte plus aisés à préparer et observe qu’appliquée sur des anneaux déjà contractés par la noradrénaline, l’Ach devient vasodilatatrice. Il cherche la raison de cette différence majeure et, esprit bien fait, pense que cela peut venir des conditions de préparation des bandelettes et des anneaux. De fait, à l’aide d’un simple examen histologique, il montre que la difficile dissection des bandelettes s’accompagne d’une quasi destruction de l’endothélium vasculaire alors que celui-ci reste présent dans les anneaux. Il fait alors l’hypothèse qu’avec les bandelettes, l’Ach entre directement en contact avec les cellules musculaires lisses de la paroi et est logiquement constrictrice tandis que lorsqu’elle peut agir sur des cellules endothéliales, cas des anneaux, elle devient dilatatrice. Il confirme ensuite son hypothèse en montrant que si, par frottement mécanique, on enlève l’endothélium des anneaux l’Ach redevient vasoconstrictrice (Fig. 1). C’est donc l’action de l’Ach sur des récepteurs portés par la cellule endothéliale qui libère un médiateur lequel diffuse vers les cellules musculaires lisses sous jacentes et les mets au repos.

Fig. 1. — Réponses d’un anneau aortique de Lapin précontracté par la Noradrénaline (NE) à l’acétycholine avant (unrubbed) et après (rubbed) enlèvement de l’endothélium. D’après Furchgott et al (1989).

L’identification du médiateur fut l’aboutissement d’un long travail mené avec L. Ignarro et F. Murad (co prix Nobel) [2] montrant que la vasodilatation est secondaire à l’activation d’une enzyme endothéliale la NO synthase qui à partir d’un acide aminé, l’arginine, libère un gaz l’oxyde nitrique (NO). Ce dernier très diffusible quitte la cellule endothéliale et va dans la cellule musculaire activer une guanylcyclase qui produit du GMPc provoquant la dilatation. Ce GMPc est lui-même détruit in situ par des phosphodiesterases en particulier celle du type 5.

En élucidant le mécanisme des effets vasodilatateurs de l’Ach ils permettaient enfin de comprendre l’action coronarodilatatrice des dérivés nirés donneurs de NO comme la nitroglycérine utilisée comme telle depuis plus d’un siècle (1870).

Mais l’aventure ne s’arrête pas aux nitrés. En effet, en recherchant des composés capables d’augmenter les concentrations de NO au niveau vasculaire et donc d’obtenir des molécules possiblement antihypertensives et coronarodilatatrices, des chercheurs d’un laboratoire américain eurent l’idée de tester des inhibiteurs de la phosphodiestérase 5 qui détruit le NO. Avec les composés les plus actifs et spécifiques obtenus, les essais cliniques de phase 1 montrèrent, chez des volontaires sains de sexe masculin, l’absence de coronarodilatation mais l’apparition fréquente de céphalées et d’érections. Loin de se décourager ils optimisèrent cette dernière propriété et développèrent le sildénafil (Viagra), à l’origine d’une avancée pharmacologique non dépourvue d’importance : le traitement des dysfonctions érectiles.

Voici comment une étude très banale de physiologie vasculaire chez le lapin a bouleversé nos connaissances quant à la régulation des flux sanguins locaux et créé une nouvelle classe thérapeutique. Cet exemple semble intéressant à trois titres :

— il illustre comment une utilisation quantitativement modeste mais rationnelle de l’animal d’expérience peut se révéler cruciale pour la mise en évidence d’un mécanisme physiologique d’importance majeure, — il démontre que, même de nos jours, une découverte n’est, heureusement, pas toujours dépendante d’un important et onéreux effort technologique car elle peut être le simple fruit des capacités d’analyse d’un esprit bien préparé, — enfin il prouve magnifiquement que personne ne peut prédire les conséquences d’une recherche fondamentale et donc en définir l’utilité. C’est ce qui fait toute la difficulté de la gestion de la recherche.

Effets antidépresseurs d’un agoniste mélatoninergique

La dépression est une pathologie sévère dont la prévalence est en progression dans nos sociétés développées. Cette maladie est objectivée par l’appréciation de plusieurs critères cliniques qui correspondent aux symptômes pathognomoniques reconnus dont l’humeur triste, l’anhédonie, la perte de l’élan vital, la fatigue chronique. Les troubles du sommeil, ses déficits tant qualitatifs que quantitatifs, et les désordres des rythmes circadiens font aussi partie intégrante de ces critères. La mélatonine, connue pour ses fonctions physiologiques de régulation des rythmes circadiens, était donc logiquement candidate à la prise en charge d’au moins une partie de cette pathologie. Malheureusement, testée dans plusieurs études cliniques, elle n’avait jamais démontré de propriétés antidépressives.

De façon à approfondir les relations mélatonine-dépression un nouveau modèle d’anhédonie a été mis au point. Ce modèle consiste à mettre des rats en situation de stress modérés mais imprévisibles et constamment renouvelés [3], ce qui conduit les animaux à une diminution de leur capacité à rechercher et éprouver du plaisir (anhédonie), capacité que l’on peut aisément évaluer en mesurant leur appétence pour une solution sucrée qu’ils apprécient tout particulièrement à l’état normal. De fait les rats placés dans cet environnement perpétuellement modifié (voir tableau I) consomment beaucoup moins de sucrose que les animaux témoins. Après quatre à cinq semaines d’exposition aux agents stressants les animaux reçoivent alors les produits à tester soit le soir, soit le matin. Le schéma expérimental comporte un groupe témoin non stressé, un groupe stressé, et un groupe stressé recevant 50 mg/kg/j de mélatonine.Laquantitéd’eausucréeingéréeestmesuréetoutaulongdel’expérience.

Tableau I : modèle expérimental d’anhédonie Matin Après midi Nuit Lundi Inclinaison cage (1h) accès difficile à la nourriture Mardi Confinement (1h) 2 rats/cage (2h) Lumière toute la nuit Mercredi Inclinaison cage (1h) Confinement (2h) Inclinaison cage Jeudi 2 rats/cage (2h) Confinement (1h) Cage salie Vendredi Confinement (1h) Inclinaison cage (1h) Week-end Inversion du cycle lumière/obscurité Fig. 2. — Consommation de sucrose chez des rats normaux (- -) ou rendus anhédoniques contrôlés (…) ou traités par de la mélatonine (—) en administration vespérale ou matinale. D’après Papp, et al (2002).

Preuve que le concept est vrai : dans ces conditions la mélatonine est active en administration vespérale — i.e : lorsque ses récepteurs sont exprimés — et non matinale (Fig. 2). Ceci a conduit des chercheurs d’un laboratoire français à rechercher des molécules ayant des propriétés agonistes mélatoninergiques. Ainsi est née l’agomé- latine qui, par hasard, associe à ses propriétés agonistes mélatoninergiques, celles d’antagoniste des récepteurs 5HT2c de la sérotonine dont le rôle dans la dépression est aussi connu [4]. Du fait de ses deux activités l’agomélatine se révèle active dans ce modèle d’adhédonie quelle soit administrée le soir ou le matin (Fig. 3).

Fig. 3. — Consommation de sucrose chez des rats normaux (- -) ou rendus anhédoniques contrôles (…) ou traités par l’agomélatine (—) en administration vespérale ou matinale. D’après Papp, et al (2002).

On imagine combien il eut été difficile d’apporter la preuve de la validité d’un tel concept thérapeutique lors d’études cliniques en particulier dans le cadre d’une pathologie aussi complexe que la dépression. Depuis, ces données expérimentales ont été confirmées par de nombreux travaux cliniques qui ont permis à l’agomélatine d’obtenir une autorisation européenne de mise sur le marché (2009).

Le chien et l’amaurose congénitale de Leber

Ce sera notre dernier exemple qui démontre comment l’étude de l’animal peut mener à mieux comprendre une pathologie humaine et à pouvoir en envisager le traitement.

Il s’agit de la découverte d’une atrophie rétinienne dans certains élevages très consanguins de chiens Briard qui les rend aveugles et a fait évoquer la dramatique amaurose congénitale de Leber (1869), caractérisée par une faible réponse de la pupille à la lumière, une photophobie, un nystagmus et une rapide évolution vers la cécité. L’étude de ces chiens a mis en évidence une délétion de quatre paires de base dans le gène codant pour la « retinal pigment epithelium 65kda protein » (RPE65).

Cette protéine exprimée dans l’épithélium rétinien est une isomerohydrolase qui intervient dans la régénération du rétinol pigment indispensable au bon fonctionnement des cônes et bâtonnets.

La même mutation ayant été trouvée chez certains des sujets présentant une amaurose congénitale de Leber, la question s’est posée de savoir si une thérapie génique consistant à introduire le gène normal de la RPE65 pouvait faire espérer une amélioration voire une guérison de cette atteinte autosomique récessive pour laquelle aucun traitement n’existe.

Deux séries de travaux ont, à cet égard, été d’un intérêt considérable. Les premiers [5] ont montré que chez le chien déficient homozygote pour la RPE65 l’injection sous-rétinienne du gène normal porté par un adénovirus recombinant amenait une amélioration très significative des réponses électriques rétiniennes ainsi que de la réactivité pupillaire (Fig. 4). De plus une étude comportementale montrait que, même dans une semi-obscurité, les chiens traités évitaient beaucoup mieux les obstacles que les chiens non traités.

Les seconds [6] visaient à évaluer l’efficacité potentielle d’une approche de thérapie génique chez des sujets privés de sensations visuelles depuis longtemps. Pour ce faire Aguirre et coll . ont étudié par résonance magnétique fonctionnelle des chiens homozygotes pour la délétion de la RPE65, jeunes ou âgés de un à quatre ans, et ce trois et trente mois après injection du gène normal introduit dans le vecteur adénoviral. Avant traitement les réponses rétiniennes comme celles des aires visuelles primaires à des stimulus lumineux sont très faibles. La thérapie génique les améliore significativement et, fait important, cette amélioration persiste jusqu’à trente mois. Toujours par résonance magnétique ces auteurs montrent, chez six malades présentant une délétion du gène de RPE65 que les lésions organiques — diamètre du nerf optique et épaisseur du cortex occipital sont, malgré toute absence de stimulation, modérément diminuées. Quant aux réponses corticales elles sont amoindries pour de faibles stimulus lumineux mais normales pour les stimulus puissants. Au total, ce travail permettait de penser qu’une thérapie génique pourrait être utile chez l’homme.

Fig. 4. — Réponses électrorétinographiques à un stimulus de lumière bleue après adaptation à l’obscurité chez un chien normal, un chien mutant pour la RPE avant et après traitement par injection sous rétinienne d’un adenovirus porteur du gêne normal codant pour la RPE65.

D’après GM. Acland (2001).

Depuis divers groupes l’ont tentée [7, 8]. La procédure s’est avérée bien tolérée et largement, quoique non totalement, efficace. Surtout et de façon très intéressante l’amélioration est restée stable plus de douze mois après le traitement.

Pour finir s’il est évident que dans le domaine de la pharmacologie, comme dans d’autres, l’animal a beaucoup apporté à l’homme il convient de rappeler que l’homme a aussi rendu quelques services à l’animal. En effet, beaucoup de traitements vétérinaires dérivent de ceux mis au point pour l’homme. Tel est par exemple le cas récent d’un inhibiteur de la tyrosine kinase utilisé chez l’homme et qui se révèle efficace pour le traitement des mastocytomes du chien. Il est même des cas, plus rares et plus anciens, il est vrai, où l’homme a constitué le sujet d’expérience. Ainsi les anesthésiques ont tous été testés chez l’homme d’abord. Reconnaissance enfin que les travaux expérimentaux menés chez l’animal aient aussi permis de mieux connaître les conditions physiques et psychologiques capables de leur assurer un développement optimal.

EN CONCLUSION

La contribution animale à la pharmacologie a été et restera encore longtemps essentielle. Si l’importance quantitative de l’utilisation de l’animal d’expérience est très heureusement en baisse constante il n’en est pas tout à fait de même pour son importance qualitative. Les travaux de physiologie et de physiopathologie, l’amélio- ration des modèles animaux grâce en particulier aux modifications génétiques qui en humanisant les caractéristiques animales rendent leur contribution encore plus prédictive de ce qui se passera chez l’homme, continueront à faire naître les nouveaux concepts qui sous-tendent le progrès pharmacologique. La confirmation de la validité de ces concepts nécessitera le recours à l’animal. Au terme de ce cheminement intellectuel c’est bien sûr, à la clinique, et à la pharmacologie clinique, que reviendra toujours le dernier mot. Ainsi l’animal est certes le meilleur ami de l’homme mais l’homme encore indispensable à l’homme deviendra, grâce à un respect toujours plus scrupuleux de la dimension éthique de l’expérimentation, de plus en plus un ami de l’animal.

REMERCIEMENTS

Les auteurs présentent leurs plus vifs remerciements aux Professeurs A. Parodi et M. Girard ainsi qu’au Docteur P. Schiavi qui leur ont communiqué des informations très utiles pour l’écriture de cet article.L’aide de G. Fleury pour la mise en page de cet article a été précieuse.

BIBLIOGRAPHIE [1] Furchgott R-F., Vanhoutte P-M. — Endothelium derived relaxing and contracting factors.

Faseb. J ., 1989, 3 , 007-2018.

[2] Ignarro L-J. — Nitric oxide. A novel signal transduction mechanism for transcellular communication. Hypertension, 1990, 16 , 477-483.

[3] Papp M., Gruca P., Boyer P-A., Mocaer E. — Effect of agomelatine in the chronic mild stress model of depression in the rat. Neuropsychopharmacology, 2003, 28 ,694-703.

[4] Stahl S-M. — Psychopharmacologie essentielle. Medecine-Sciences.

Flammarion 2002, 245- 295.

[5] GM. Acland G., Aguirre G.D., Ray J., Zhang Q., Aleman T.S., Cideciyan A.V. et al . —

Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness.

Nature genetics, 2001, 28 , 92-95.

[6] Aguirre G.K., Komaromy A.M., Cideciyan A.V., Brainard D.H., Aleman T.S., Roman A.J. et al . — Canine and human visual cortex intact and responsive despite early retinal blindness from RPE65 mutation.

PLoS Medicine, 2007, 4, 1117-1127.

[7] Cideciyan A.V., Aleman T.S., Boye S.L., Schwartz S.B., Kaushal S., Roman A.J. et al . —

Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cucle of vision but with slow rod kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105 , 15112-15117.

[8] Bainbridge J.W., Smith A.J., Barker S.S. — Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital amaurosis. N. Engl. J. Med, 2008, 358 , 2231-2239.

DISCUSSION

M. Pierre GODEAU

La connaissance de cette mutation du gène SRE 65 chez le chien briard a-t-elle conduit les éleveurs à une sélection permettant d’éliminer les chiens porteurs de cette mutation pour en éliminer le risque de cécité ?

Les éleveurs qui rencontrent ce genre de difficulté liée à des atteintes génétiques récessives, la résolvent par des croisements non consanguins.

Bull. Acad. Natle Méd., 2009, 193, no 8, 1757-1766, séance du 10 novembre 2009