Communication scientifique
Séance du 13 novembre 2001

Protection in vitro des fonctions mitochondriales cérébrales par le E-resvératrol dans les états d’anoxie suivie de réoxygénation

MOTS-CLÉS : anoxie. anti-enzymes. antioxydant. consommation oxygène. encéphale. mitochondrie. resvératrol.. stilbènes
Protection of CNS mitochondrial functions by E-resveratrol in anoxia followed by reoxygenation
KEY-WORDS : anoxia. antioxidants. brain. enzyme inhibitors. mitochondria. oxygen consumption. resveratrol.. stilbenes

J-P. Tillement

Résumé

Nous avons recherché sur un modèle expérimental d’anoxie-réoxygénation appliqué à des suspensions de mitochondries isolées d’encéphale de Rat, les effets du resvératrol ajouté à la préparation ou injecté au préalable à des rats dont on a ensuite extrait les mitochondries. Sur ce modèle, on observe que le resvératrol s’oppose aux effets découplants induits par l’anoxie et la réoxygénation. Il inhibe ainsi totalement la libération de cytochrome c intermembranaire, stade initial de l’apoptose mitochondriale, et s’oppose à la formation d’ATP qui l’effectue. Ces effets sont concentration-dépendants et s’observent à des concentrations très basses. On en conclut que le resvératrol limite ou supprime les effets délétères mitochondriaux provoqués par une anoxie suivie de réoxygénation.

Summary

Using an experimental model of anoxia-reoxygenation applied to suspensions of mitochondria isolated from rat cortex, we have searched the effects of resveratrol added to the suspension or previously injected to rats from which mitochondria were extracted. With this model, we observe that resveratrol counteracts decoupling effects induced by anoxiareoxygenation. It also fully inhibits intermembrane cytochrome c release, initial step of mitochondrial apoptosis and blocks ATP generation which achieves it. These effects are concentration- dependent and take place at low concentrations. It is concluded that resveratrol limits or suppresses the mitochondrial deletereous effects promoted by anoxia followed by reoxygenation.

INTRODUCTION

Différentes substances anti-oxydantes sont actuellement proposées pour limiter les effets toxiques cellulaires de la génération d’un excès de radicaux libres de l’oxygène (RLO). Ces substances sont formées en quantité (pathologique) importante lorsque la chaîne respiratoire mitochondriale ne peut réduire complètement la totalité de l’oxygène qu’elle reçoit. Cette situation s’observe principalement dans le stress oxydatif, dans les cas de reperfusion lorsque celle-ci succède à une ischémie et de façon plus générale dans le vieillissement cellulaire.

Le E-resvératrol ou trans-resvératrol, 3, 4, 5, -trihydroxy-E-stilbène (nommé ensuite resvératrol dans le texte), est une phytoalexine [1] qui développe expérimentalement des propriétés anti-oxydantes, plus précisément de capture et d’inactivation des RLO. Elles semblent être à l’origine de plusieurs effets pharmacologiques intéressants de cette substance, anti-inflammatoire [2], antiagrégant plaquettaire [3], antiischémique cardiaque [4] et plus récemment anti-tumoral [5]. Ce dernier effet a été démontré in vitro sur des lignées de cellules de cancer mammaire et semble lié aux propriétés oestrogéniques du resvératrol, qui est un agoniste partiel des récepteurs de l’oestradiol [6].

Pour notre part, considérant que ces effets anti-oxydants pourraient se développer dans d’autres organes sous réserve que le resvératrol les atteigne en quantité suffisante, nous avons recherché, dans un premier temps, les effets du resvératrol sur le SNC en utilisant un modèle simplifié, les mitochondries isolées du cerveau de Rat.

Nous avons pu ainsi montrer que cette substance piège les radicaux libres de l’oxygène, mais empêche aussi leur formation à partir du complexe III de la chaîne respiratoire mitochondriale [7].

L’activité enzymatique de ce dernier étant inhibée de façon compétitive par le resvératrol, il était donc tentant d’en rechercher l’effet éventuel sur des modèles plus complexes. Nous avons retenu un protocole d’anoxie suivie de réoxygénation appliqué à des suspensions mitochondriales d’encéphale de Rat mises soit en présence de concentrations croissantes de resvératrol, soit extraites de cerveaux de rats auxquels cette substance a été administrée de façon continue pendant une semaine.

Sur ces deux types de préparations mitochondriales, nous avons recherché si le resvératrol modifiait les altérations fonctionnelles provoquées par les séquences d’anoxie avec ou sans réoxygénation et, si oui, dans quel sens.

Plusieurs fonctions mitochondriales ont été étudiées, la respiration basale et la phosphorylation oxydative, la production d’anion superoxyde (O °-), la résistance 2 aux agents découplants. Une prévention éventuelle du déclenchement de l’étape mitochondriale de l’apoptose a été recherchée en mesurant l’effet du resvératrol sur la libération du cytochrome c intermembranaire et sur l’activité de la NADH — cytochrome b oxydoréductase qui, en présence de cytochrome c et de NADH (en 5 excès), active le complexe IV qui permet la génération de l’ATP qui déclenche l’apoptose.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Réactifs

Tous les réactifs utilisés sont de qualité pure pour analyse et sont fournis par différents laboratoires. Le resvératrol est solubilisé dans un mélange de diméthylformamide et d’eau distillée (parties égales), la solution mère est à 10-3 M. Tous les témoins utilisent le même solvant : les solutions finales ne contiennent pas plus de 0,05 % de diméthylformamide.

Méthodes

Isolement des mitochondries de cerveau

Elles sont extraites à partir d’un homogénat de deux encéphales de Rat par centrifugations différentielles sur gradient de Percoll, selon la méthode décrite par Sims [8]. Le culot est mis en suspension dans un tampon de respiration (mannitol 300 mM, KH PO , 10 mM, KCl 10mM, Mg Cl 5 mM, pH = 7,2 à 37° C) maintenu à 2 4 2 4° C.

Mesures de la consommation d’oxygène par les mitochondries

Elles utilisent une micro-électrode de Clark. Les mitochondries sont préincubées 15 min à 4° C avec (ou sans) resvératrol puis incubées 1 min à 37° C dans le tampon de respiration (avec ou sans inhibiteurs). La respiration mitochondriale est provoquée par l’ajout de malate/glutamate, substrat du complexe I. La consommation d’oxygène est mesurée (V ). La phosphorylation oxydative est ensuite provoquée 4 par l’ajout d’ADP et la nouvelle consommation d’oxygène est mesurée (V ). Le 3 contrôle respiratoire (CR) est égal à V /V 3 4.

L’oligomycine est utilisée pour inhiber le complexe V, la carbonylcyano m-chlorophénylhydrazone (CCCP) est utilisée comme découplant. L’activité de la NADH-cytochrome b oxydoréductase est mesurée par la méthode décrite par La 5 Piana et coll. [9].

Protocole d’anoxie-réoxygénation in vitro

Les conditions d’anaérobie sont obtenues en incubant les mitochondries dans une chambre close maintenue à 37° C. Le mélange malate/glutamate est utilisé comme substrat : un ajout d’ADP permet ensuite de consommer tout l’oxygène présent.

Après 5 min d’anoxie, la réoxygénation est obtenue par ouverture de la chambre et addition de tampon respiratoire frais. Puis 5 min après, la chambre est à nouveau fermée et le contrôle respiratoire est mesuré comme précédemment. Les témoins sont traités dans les mêmes conditions mais sans anoxie. Des concentrations croissantes de resvératrol sont introduites dans la chambre d’incubation, soit avant les deux séquences, soit au moment de la réoxygénation. La suspension mitochondriale est ensuite centrifugée, le cytochrome c est mesuré dans le surnageant par une méthode immuno-enzymatique.

La production de O °- au cours de la réoxygénation est quantifiée par la méthode du 2 bleu de nitrotétrazolium.

L’anisotropie des membranes mitochondriales est mesurée à l’aide d’une sonde, le 1,6-diphényl — 1, 3, 5 hexatriène (DPH) par polarisation de fluorescence selon les méthodes décrites par Mecocci et coll. [10] et Ricchelli et coll. [11].

Injection chronique de resvératrol

Les rats sont anesthésiés par une injection SC de chloral (400 mg/Kg). Une petite incision interscapulaire permet d’implanter une mini-pompe osmotique délivrant 1 µl/h de solution de façon continue pendant 7 jours. Le resvératrol est injecté à différentes concentrations 0,4, 2 et 10 mg/Kg/j dissous dans un mélange de diméthylsulfoxyde-polyéthyléneglycol (1/9), les rats témoins reçoivent le seul solvant. Le 8e jour, les animaux sont sacrifiés. Les mitochondries de l’encéphale sont isolées. On les utilise pour mesurer les contrôles respiratoires avant et après les avoir soumises au protocole d’anoxie-réoxygénation.

Analyses statistiques

Les valeurs moyennes des CR ou les pourcentages de variation sont comparés selon les méthodes d’analyse de variance et le test de Dunnett. Les EC sont calculées par 50 régression non-linéaire à l’aide d’un logiciel Micropharm® [12].

Résultats

Les effets du resvératrol dans le protocole d’anoxie-réoxygénation

Restauration partielle du contrôle respiratoire mitochondrial

Après les séquences successives d’anoxie puis de réoxygénation, le CR diminue d’environ 50 % (Fig. 1). La respiration basale (V ) augmente de 39,7 fi 1,8 à 50,4 fi 4 1,8 nmoles O /min/mg de protéines.

2

FIG. 1. — Modifications par le resvératrol des paramètres respiratoires des mitochondries cérébrales de Rat soumises au protocole d’anoxie-réoxygénation. Les valeurs indiquées sont les moyennes (M fi SD) de 4 déterminations. Les consommations d’oxygène correspondant à la respiration basale (V ) et à la phosphorylation oxydative (V ). Le coefficient respiratoire, CR, est égal à 4 3 V /V .

3 4 La phosphorylation oxydative (V ) diminue de 103,6 fi 4,8 à 82,8 fi 4,0 nmoles 3 O /min/mg de protéines. Lorsque le resvératrol est appliqué avant les deux séquen2 ces, il limite la chute du V , restaure en partie V et limite ainsi partiellement mais 4 3 significativement la diminution du CR. Les caractéristiques de ces effets sont qu’ils commencent à de très faibles concentrations (10-12M), sont concentrationdépendants et ne sont que partiels. La restauration de V et la normalisation de V 3 4 suivent des évolutions biphasiques dont les caractéristiques sont indiquées sur le Tableau I. Il n’existe pratiquement pas de différence d’intensité d’effet du resvératrol lorsqu’il est administré avant les deux séquences ou seulement après l’anoxie. Son effet porte donc essentiellement sur l’étape de réoxygénation.

Inhibition de la libération de cytochrome c

Il existe une libération spontanée de cytochrome c par les préparations mitochondriales, évaluée à 226,4 fi 30,7 ng/mg de protéines. La séquence d’anoxieréoxygénation augmente significativement cette libération : 425,1 fi 38,6 ng/mg de protéines. Quel que soit son temps d’application, le resvératrol inhibe la libération de cytochrome c induite et restaure totalement l’état initial à la concentration de 10 nM (Fig. 2). Ses effets sont concentration-dépendants.

TABLEAU 1. — Effets du resvératrol sur les paramètres respiratoires des mitochondries soumises au protocole anoxie-réoxygénation. Les conditions opératoires sont identiques à celles de la Figure 1. Les résultats sont exprimés en EC et en effet maximal observé, Emax en % des valeurs des 50 témoins. Les effets du resvératrol sont biphasiques, quel que soit le moment de son application, les concentrations efficaces étant de l’ordre du picomolaire puis du nanomolaire.

V

V CR 3 4 EC 1 (pM) 1.56 fi 0.33 4.17 fi 1.46 5.79 fi 1.23 50 resvératrol avant

Emax1 (%) 10.4 fi 0.35 7.99 fi 0.37 11.83 fi 0.48 anoxie-réoxygénation

EC 2 (nM) 2.64 fi 0.68 8.50 fi 1.41 11.61 fi 2.64 50 Emax2 (%) 7.57 fi 0.31 12.02 fi 0.56 11.51 fi 0.58 EC 1 (pM) 2.93 fi 0.53 2.95 fi 0.63 1.47 fi 0.25 50 resvératrol avant

Emax1 (%) 10.60 fi 0.27 11.31 fi 0.47 11.39 fi 0.48 réoxygénation

EC 2 (nM) 1.03 fi 0.51 3.70 fi 1.24 2.27 fi 0.38 50 Emax2 (%) 4.26 fi 0.28 11.66 fi 0.71 11.33 fi 0.38 Inhibition de l’augmentation de production de O °- 2

Les deux séquences successives augmentent significativement la génération de O °- 2 .

Le resvératrol, quel que soit le moment de son application, réduit cette augmentation (Fig. 3). Son effet est concentration-dépendant et commence dès 1 nM.

Restauration de la fluidité membranaire mitochondriale

L’anisotropie des membranes mitochondriales est significativement augmentée par la séquence d’anoxie-réoxygénation. Le resvératrol la restaure de façon identique, quel que soit le moment de son application (Fig. 4).

Les effets du resvératrol sur les stades précoces de l’apoptose mitochondriale

Le stade précoce de l’apoptose mitochondriale est reproduit en provoquant un flux d’électrons (e-) dans la matrice mitochondriale à travers les deux membranes.

Celui-ci active la cytochrome c oxydase (complexe IV) qui réduit l’oxygène en eau.

Il en résulte une augmentation de la consommation d’oxygène. Le resvératrol la réduit partiellement mais significativement (Fig. 5).

Les effets du resvératrol sur le découplage provoqué des mitochondries

Le resvératrol réduit de façon partielle mais significative le découplage induit par le CCCP. L’effet est là aussi biphasique comme observé avec le CR des mitochondries soumises à la séquence d’anoxie-réoxygénation (Fig. 6).

FIG. 2. — Suppression par le resvératrol de l’augmentation de la libération de cytochrome induite par l’anoxie-réoxygénation. Le resvératrol a été ajouté à la préparation soit avant les deux séquences, soit après l’anoxie avant la réoxygénation.

L’effet du pré traitement chronique par le resvératrol sur le contrôle respiratoire mitochondrial

Le resvératrol appliqué aux mitochondries isolées des encéphales des rats traités ne modifie par leurs paramètres respiratoires. Lorsque ces mitochondries sont soumises aux deux séquences d’anoxie puis de réoxygénation, on observe que le pré traitement réduit partiellement mais significativement les altérations produites chez les témoins (Fig. 7). Le CR est significativement augmenté à la dose de 10 mg/kg (SC, une semaine). Ces résultats montrent que le resvératrol administré par voie sous-cutanée développe des effets analogues à ceux observés in vitro sur des mitochondries d’animaux non traités.

FIG. 3. — Inhibition par le resvératrol de la production d’anion superoxyde (O °-) induite par 2 l’anoxie-réoxygénation. Le resvératrol a été ajouté à la préparation avant les deux séquences ou après l’anoxie avant la réoxygénation.

DISCUSSION

Le protocole d’anoxie-réoxygénation utilisé provoque une augmentation de la consommation basale d’oxygène des mitochondries, une diminution de leur capacité de phosphorylation et en conséquence une chute de leur coefficient respiratoire.

Le découplage des mitochondries résulte d’une diminution du potentiel de la membrane interne mitochondriale, il s’accompagne d’une augmentation de la perméabilité de celle-ci aux protons qui rentrent dans la matrice sans passer par le complexe V. Sur ce modèle, le resvératrol limite l’intensité des altérations induites.

Ses effets sont seulement partiels sur le coefficient respiratoire (restauration de 22 % à 10-7M) : ils s’observent aussi bien lorsque le resvératrol est appliqué avant la double séquence que lorsqu’il est introduit après l’anoxie et avant la réoxygénation.

FIG. 6. — Inhibition par le resvératrol de l’augmentation de la consommation d’oxygène induite par le CCCP. Les consommations d’oxygène sont comparées après ajout de CCCP (10 µM) en présence de concentrations croissantes de resvératrol. Les valeurs indiquées sont les moyennes (M fi SD) de 5 expériences. La valeur basale du témoin est 162 fi 4 nmoles d’O / min/mg de 2 protéines.

Dans les deux cas on observe que l’effet est bimodal aussi bien dans la restauration de la phosphorylation oxydative que dans la normalisation (diminution) de la respiration basale. Le fait que l’activité du resvératrol soit légèrement mais significativement plus grande lorsqu’il est appliqué avant la double séquence montre que si son effet majeur porte sur la réoxygénation, il est déjà actif au stade de l’anoxie.

L’effet prépondérant du resvératrol sur la réoxygénation s’explique facilement par ses propriétés antioxydantes qui sont bien établies [7, 12, 14, 15]. L’effet recouplant observé sur ce modèle est confirmé par la réversion des effets découplants induits par le CCCP : le fait que ces deux résultats aient été observés à des concentrations voisines (EC = 5,79 pM et EC = 10 pM) permet d’affirmer que le resvératrol est 50 50 un agent recouplant dans les états d’anoxie suivie de réoxygénation.

Le présent modèle d’anoxie-réoxygénation induit aussi une augmentation de la production d’O °-. Dans l’anoxie, la phosphorylation oxydative s’arrête rapide2 ment, le manque d’apport d’oxygène conjugué au métabolisme des substrats des complexes I et II fait que tous les transporteurs des e- mitochondriaux sont sous forme réduite [16]. Toutefois, dans le cerveau, à la différence d’autres organes, la phosphorylation oxydative est plus sensible à l’hypoxie et s’accompagne déjà d’une augmentation de production d’O °- [17]. Lorsque l’apport d’oxygène est rétabli, la 2

FIG. 7. — Effet du traitement chronique par le resvératrol sur les paramètres respiratoires de l’anoxie-réoxygénération. Les paramètres sont les mêmes que ceux de la Fig. 1. Les mitochondries ont été isolées d’encéphale de rats traités par des doses variables de resvératrol, injectées par voie sous-cutanée, pendant une semaine.

phosphorylation oxydative ne reprend qu’en partie car le flux normal d’électrons dans la chaîne respiratoire est limité par l’auto-oxydation de chaque cytochrome encore sous forme réduite [17]. Il en résulte une flambée de radicaux libres, issus en particulier du complexe III [18].

C’est la raison pour laquelle de nombreux auteurs [16, 17, 19] ont souligné que le stade de réoxygénation était plus toxique que celui de l’anoxie car il générait des RLO toxiques, en particulier O °-, H 0 puis en l’absence de quantités suffisantes de 2 2 2 superoxyde dismutase (Mn SOD), OH° qui en présence de NO° est transformé en peroxynitrite (ONO -) [20].

2 Tous ces radicaux libres de l’oxygène provoquent une oxydation sévère donc une destruction des lipides et des protéines membranaires. Ces altérations s’observent dans les accidents vasculaires cérébraux [19]. Nous avons vérifié que, dans notre modèle, sans protection, les mêmes dégradations se produisent (mise en évidence de peroxydations par la réduction du bleu de nitrotétrazolium.)

Le resvératrol inhibe partiellement l’augmentation d’O °- de façon concentration2 dépendante. L’effet s’observe lorsqu’il est appliqué à l’ensemble des séquences ou avant la seule réoxygénation. Il est plus important dans le premier cas ce qui confirme qu’un excès de RLO est déjà produit pendant la phase d’anoxie. Il s’explique par l’effet de piégeage des RLO du resvératrol, mais beaucoup plus vraisemblablement par l’inhibition de leur production par le complexe III, que nous avons décrite précédemment [7].

On peut observer en effet que l’EC de l’inhibition de l’activité enzymatique du 50 complexe III, 5,49 nM, est voisine du seuil d’inhibition de la production de O °-, 2 1 nM (Fig. 4).

Le modèle d’anoxie-réoxygénation provoque aussi la dissociation du cytochrome c de son ancrage à la membrane interne. Il reproduit ainsi une étape précoce des effets du stress oxydatif [21] et déclenche, par sa libération dans le tampon d’incubation, l’étape mitochondriale de l’apoptose [22]. Le cytochrome c en présence de NADH, d’oxygène et de NADH-cytochrome b oxydo-réductase, provoque le transfert 5 direct d’équivalents réducteurs (e-) de l’extérieur à l’intérieur de la matrice mitochondriale. Il génère ainsi un potentiel de membrane qui permet l’activation du complexe IV puis la synthèse d’ATP (l’activation du complexe V) nécessaire au développement de l’apoptose [22, 23]. On observe que le resvératrol inhibe totalement à 10-7 M, la libération de cytochrome c induite par l’anoxie-réoxygénation.

Son efficacité n’est pas différente lorsqu’il est appliqué avant la double séquence ou avant la seule réoxygénation, ce qui suggère que le phénomène apoptotique mitochondrial est déclenché par le retour de l’oxygène.

En diminuant la consommation d’oxygène en présence d’un excès d’ADP, le resvé- ratrol diminue la synthèse d’ATP qui exécute l’apoptose (à 10-9M). Comme il a été déjà démontré qu’il est sans effet sur le complexe IV [7], il ne peut être que soit un inhibiteur direct de la NADH cytochrome b oxydoréductase, soit agir par son effet 5 recouplant.

Le fait que la diminution de synthèse d’ATP par le système bitransmembranaire ne soit que partielle est peu compatible avec une inhibition enzymatique, mais suggère que c’est l’effet recouplant du resvératrol qui est opérant.

L’anoxie suivie de la réoxygénation provoque une augmentation de l’anisotropie des membranes mitochondriales, qui indique une rigidification de leur architecture et donc une diminution de leur fluidité. Elle est due principalement aux effets des RLO.

Le resvératrol (10-7 M) inhibe totalement cette perte de fluidité : ses effets ne sont pas différents s’il est appliqué avant la double séquence ou avant la seule réoxygénation.

Ce résultat confirme, par une méthode physique, les effets protecteurs membranaires déjà observés du resvératrol.

CONCLUSION

On peut donc conclure que le resvératrol limite in vitro les effets délétères de l’anoxie-réoxygénation sur les fonctions mitochondriales des cellules cérébrales.

Cette protection inclut un maintien partiel du contrôle respiratoire, une réduction de production de RLO et une inhibition totale de la libération de cytochrome c. Ces effets sont dus principalement à une action recouplante mitochondriale, à l’inhibition partielle de la génération de RLO et au piégeage de ceux qui persistent. Ils s’accompagnent d’une conservation partielle de la fluidité membranaire.

Après administration chronique (SC) de resvératrol à des rats, leurs mitochondries (extraites du cerveau) présentent une résistance à l’anoxie-réoxygénation analogue à celle observée in vitro . Il en résulte que le resvératrol limite in vivo les effets délétères de l’anoxie-réoxygénation en protégeant les fonctions mitochondriales des cellules cérébrales.

Ces observations expérimentales pourraient expliquer, au moins en partie, les effets protecteurs de certaines fonctions cérébrales, en particulier cognitives, qui sont attribués à la consommation de certains vins [24]. Toutefois, il n’est pas possible d’établir une relation de causalité entre les observations cliniques et expérimentales car les études épidémiologiques n’ont pas inclus de dosages sanguins de resvératrol.

On ne sait donc pas si les sujets étudiés avaient reçu et résorbé cette substance. En revanche, chez le Rat, l’administration chronique orale de vin a montré que le resvératrol était résorbé dans la circulation générale et que sa distribution dans l’organisme était bien décrite par une distribution bi-compartimentale, avec un compartiment dit profond qui inclut vraisemblablement le cerveau [25]. D’autre part, les résultats que nous avons obtenus montrent que les effets mitochondriaux du resvératrol surviennent ( in vitro ) à des concentrations très faibles, nano et picomolaires compatibles avec les concentrations simulées de distribution cérébrale réalisées à partir des modèles pharmacocinétiques précédents. La preuve directe de l’effet du resvératrol sur les fonctions cérébrales après administration orale reste à apporter.

REMERCIEMENTS

L’auteur adresse des vifs remerciements au docteur Roland ZINI et à M. Christophe MORIN pour leur précieuse collaboration.

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[24] ORGOGOZO J.M., DARTIGUES J.F., LAFONT S., LETENNEUR L., COMMENGES D., SALOMON R., RENAUD S., BRETELIER M.B. — Consommation de vin et démence chez les sujets âgés : étude épidémiologique prospective de terrain dans la région de Bordeaux. Rev. Neurol. (Paris), 1997, 153, 185-192.

[25] BERTELLI A.A.E., GIOVANNINI L., STRADI R., URIEN S., TILLEMENT J-P., BERTELLI A. — Kinetics of trans-and cis-resveratrol (3, 4, 5 — Trihydroxy — stilbene) after red wine oral administration in rats. Int. J. Clin. Pharm. Res., 1996, 16 , 77-81.

DISCUSSION

M. Raymond ARDAILLOU

Le E-resvératrol peut-il être utilisé pour protéger le rein greffé des conséquences de l’ischémie-reperfusion ?

Cette question est très intéressante, je ne peux y répondre actuellement. Le but de notre travail est en effet de savoir si le E-resvératrol peut être utilisé pour protéger un rein en attente de greffe. On ne sait pas s’il est actif dans l’ischémie froide : le fait qu’il soit un piégeur de radicaux libres, un inhibiteur de leur formation et un stabilisant de membrane rend cette hypothèse plausible. Les résultats obtenus nous semblent suffisants pour envisager une étude d’allogreffe rénale chez le cochon et chez le rat. Ce travail sera réalisé en collaboration avec l’équipe chirurgicale de Poitiers et le laboratoire d’expérimentation animale INRA de Surgères. Le protocole prévu consiste à ajouter le E-resvératrol au liquide de conservation. Dans une première étude, le rein n’est pas greffé mais analysé, après conservation, aux plans mitochondrial, biochimique et histologique. Dans une seconde étude, le rein est greffé et on observe la qualité de la reprise fonctionnelle.

M. Roger NORDMANN

Vous avez montré l’action du E-resvératrol administré par voie sous-cutanée au rat.

N’envisagez-vous pas de tester l’efficacité de ce polyphénol administré par voie orale ? Les
résultats d’une telle étude me sembleraient importants pour éclairer le débat concernant les effets « bénéfiques » sur l’incidence d’affections cardiovasculaires et la mortalité globale de la consommation en quantité « modérée » de vin et surtout de vin rouge (riche en E-resvératrol et autres polyphénols). Certains auteurs attribuent ces effets au resvératrol (et autres polyphénols), d’autres estiment que l’éthanol est indispensable par son action propre et en facilitant l’absorption intestinale du resvératrol. La démonstration d’une efficacité de l’administration de resvératrol en milieu non alcoolique par voie buccale représenterait un argument de poids pour la première hypothèse. Une autre façon de contribuer au débat consisterait à comparer les effets du vin à ceux du jus de raisin non alcoolisé, étude qui n’a pas été réalisée à ce jour à ma connaissance.

Vous avez tout à fait raison de souligner la contribution que ce travail peut apporter au débat sur les « effets bénéfiques » du vin. Ce n’est pas notre objectif, c’est pourquoi nous avons utilisé la voie sous-cutanée pour nous affranchir d’un problème de biodisponibilité orale. Je ne pense pas que l’alcool apporte quelque avantage aux effets du resvératrol.

Plus simplement, il semble que l’alcool soit un bon solvant du resvératrol et qu’ainsi il permette une meilleure extraction à partir des grains de raisin. En revanche une augmentation de la résorption intestinale de resvératrol par l’alcool paraît très improbable : elle n’a pas été observée à ma connaissance. Le rôle bénéfique du resvératrol dans la prévention des accidents ischémiques paraît bien établi. Notre étude permet d’inclure le cerveau dans les organes protégés. Cependant, le resvératrol n’a pas été mis en évidence dans le cerveau après ingestion de vin chez le rat. Je serai très prudent dans l’interprétation des études épidémiologiques qui observent une diminution de l’incidence des maladies cardiovasculaires chez des sujets qui consomment du vin de façon « régulière mais modérée ». Il y a certes une corrélation mais la causalité n’est pas établie. Les conditions économiques, climatiques et sociales de ces sujets sont à l’évidence des facteurs très importants à prendre en compte. Mais d’autres études comparant les effets du vin rouge à ceux d’autres boissons alcoolisées, bière, alcools forts… montrent que l’ingestion de ces derniers est corrélée à une augmentation des maladies cardiovasculaires. Votre proposition de comparer les effets d’un vin à un jus de raisin me paraît tout à fait intéressante. Je suggèrerai cependant de doser le resvératrol dans les deux boissons avant l’étude.

M. Michel BOUREL

Existe-t-il des préparations « médicamenteuses » contenant de l’E-resvératrol ? Quelle est l’origine, dans le cerveau, des mitochondries (méninges, système vasculaire ou encéphale…) ? Quelles correspondances des anomalies biologiques (cytochrome C….) au point de vue histologique (apoptose des mitochondries) ?

Je n’ai pas trouvé, au moins en France, de forme commerciale d’E-resvératrol. En revanche, il existe des compléments alimentaires dont ceux à base d’extraits de raisin, qui en contiennent probablement. Les mitochondries que nous utilisons sont extraites d’un homogénat d’encéphale. Nous n’avons pas tenté jusqu’à présent d’isoler des mitochondries de fractions cérébrales, ce qui serait probablement difficile. Les mitochondries ont la particularité de contenir un génome qui leur est propre et une double membrane comme le noyau. Leur origine est bactérienne, elles résultent d’une évolution symbiotique avec des cellules eucaryotes primitives. L’ADN mitochondrial est essentiellement d’origine maternelle. Le détachement du cytochrome c de la membrane interne mitochondriale ne peut à lui seul caractériser le phénomène d’apoptose. On admet générale-
ment que dans le cytosol, le cytochrome c en présence de NADH provoque la synthèse de l’ATP nécessaire à l’exécution de l’apoptose. Nous n’avons pas confirmé l’effet protecteur du resvératrol par une étude histologique.

M. Guy DIRHEIMER

A t-on caractérisé le transporteur du resvératrol qui permettrait à ce produit de traverser les membranes externe et interne et d’entrer dans les mitochondries ? Avez-vous dosé le resvératrol dans les mitochondries du cerveau ?

La pénétration mitochondriale du resvératrol n’a pas été étudiée. Nous pensons qu’il est transféré par diffusion passive, soit à travers les membranes, soit par l’intermédiaire d’un pore qui reste à préciser. Nous n’avons pas dosé le resvératrol dans les mitochondries de cerveau. D’autres auteurs n’ont pas réussi à le mettre en évidence dans un cerveau de Rat traité au préalable, nous avons donc choisi de rechercher un effet et non pas la substance.

M. Pierre DELAVEAU

Quelles sont les sources alimentaires de E-resvératrol autres que le raisin noir en particulier, et donc le vin rouge ? Que penser du stéréoisomère cis ou Z ?

Il est très intéressant de constater des différences quantitatives d’effets entre les deux stéréo-isomères. L’isomère CIS ou Z est très peu actif, ce qui justifie l’hypothèse d’une stéréo-sélectivité de l’effet de l’isomère trans ou E. Les sources alimentaires de E-resvératrol sont nombreuses. Outre le raisin noir, l’arachide, l’écorce de pin et de nombreux thés verts en contiennent.


* Service hospitalo-universitaire de Pharmacologie, UFR de Médecine de Paris XII, 8 rue du Général Sarrail — 94010 Créteil cedex — Tél : 01 49 81 36 61 — Fax : 01 49 81 35 94. Courriel : tillement@univ -paris12.fr Tirés-à-part : Professeur Jean-Paul TILLEMENT, à l’adresse ci-dessus. Article reçu le 29 mars 2001, accepté le 23 avril 2001.

Bull. Acad. Natle Méd., 2001, 185, no 8, 1429-1445, séance du 13 novembre 2001