Résumé
Les méthodes dites substitutives à l’expérimentation animale s’inscrivent dans le principe des ‘‘3R’’ défini par Russel et Burch en 1959. Il s’agit de méthodes qui permettent d’optimiser l’utilisation des animaux de laboratoire, de réduire le nombre d’animaux utilisés et dans le meilleur des cas de se substituer à leur utilisation. Il existe plusieurs approches qui ne sont pas basées sur l’expérimentation animale : les méthodes in silico utilisant des bases de données constituées à partir de résultats expérimentaux, les méthodes in vitro utilisant des méthodes physico-chimiques ou éléments biologiques préparés à partir d’organismes vivants ou non (systèmes enzymatiques reconstitués, bactéries, cellules, modèles de tissus reconstruits). À ces méthodes développées depuis de nombreuses années viennent s’ajouter les modèles prospectifs de substitution comme les Omiques qui s’inscrivent dans les stratégies de réduction, les cellules souches qui ouvrent des voies nouvelles pour les études toxicologiques mais également pour l’étude des maladies humaines, les organes bioartificiels et les cultures organotypiques. Peu de méthodes peuvent seules permettre de s’affranchir de l’expérimentation animale, il convient de les utiliser dans des stratégies par étapes (ITS) afin de n’utiliser l’animal qu’en dernier recours.
Summary
The use of alternative methods to animal testing are an integral part of the 3Rs concept (refine, reduce, replace) defined by Russel & Burch in 1959. These approaches include in silico methods (databases and computer models), in vitro physicochemical analysis, biological methods using bacteria or isolated cells, reconstructed enzyme systems, and reconstructed tissues. Emerging ‘‘ omic ’’ methods used in integrated approaches further help to reduce animal use, while stem cells offer promising approaches to toxicologic and pathophysiologic studies, along with organotypic cultures and bio-artificial organs. Only a few alternative methods can so far be used in stand-alone tests as substitutes for animal testing. The best way to use these methods is to integrate them in tiered testing strategies (ITS), in which animals are only used as a last resort.
INTRODUCTION
La grande majorité des méthodes substitutives utilisées par le secteur industriel pour évaluer l’efficacité et/ou la toxicité d’un produit émane des laboratoires de recherche publique même si l’objectif de première intention de ces laboratoires de recherche est de développer des outils d’étude des mécanismes biologiques sans en rechercher une application pratique ou une possibilité de réduire ou remplacer l’expérimentation animale.
On peut citer plusieurs exemples :
— Le modèle de peau reconstruite de Louis Dubertret [1] a été développé dans le but d’étudier la différenciation cellulaire cutanée. Cette technique a permis, en 1983, les premières greffes de peau humaine complètement reconstituée comprenant un derme et un épiderme équivalents, sur une dizaine d’enfants souffrant de malformations cutanées géantes. Une utilisation plus pratique a été par la suite envisagée avec l’application de ce modèle à l’étude de l’action des médicaments, comme modèle d’étude du psoriasis puis comme modèle d’étude de l’irritation pour les produits cosmétiques. D’autres modèles se sont inspirés de celui-ci pour devenir des méthodes substitutives aujourd’hui réglementaires (ligne directrice de l’OCDE a 431 pour irritation/corrosion cutanée).
— Les cultures d’hépatocytes d’origine humaine ou animale ont été développées comme modèle d’étude du fonctionnement hépatique [2]. Celles-ci sont devenues depuis des modèles très utilisés par l’industrie pharmaceutique, au stade de recherche et de développement d’un candidat médicament, pour étudier la biotransformation, les inductions/inhibitions enzymatiques potentielles pouvant être à la source d’une perte d’efficacité ou à l’origine d’une toxicité médicamenteuse.
— De la même manière, les cultures de progéniteurs hématopoïétiques ou lignées de type monocytaire destinées à l’origine à l’étude de la réponse immune ont été adaptées pour servir de modèle substitutif de prédiction de l’allergie de contact [3, 4].
Plusieurs textes réglementaires ont favorisé l’émergence de modèles substitutifs à l’expérimentation animale, le premier texte étant la directive 86/609, texte européen réglementant la protection de l’animal utilisé à des fins scientifiques. En 1993, la pression de l’opinion publique a amené les législateurs à proposer un texte réglea OCDE : Organisation du Commerce et du Développement Economique mentaire annonçant l’interdiction de l’utilisation de l’animal pour les produits cosmétiques. La directive 76/678 relative aux produits cosmétiques a ainsi été amendée sept fois avant d’imposer l’interdiction de l’utilisation de l’animal, en vigueur depuis le 11 mars 2009. Enfin, le nouveau règlement REACh qui réglemente la mise sur le marché des substances chimiques incite à la mise en œuvre de stratégies alternatives afin de ne conduire des essais sur les animaux qu’en dernier recours.
Cette communication a pour objectif de faire un état des lieux des méthodes substitutives à l’expérimentation animale actuellement disponibles, de présenter les stratégies d’utilisation de ces méthodes en fonction de leur application pratique et des cadres réglementaires. Une analyse des limites des méthodes et les perspectives d’utilisation sont également discutées.
Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale
Il existe plusieurs approches substitutives à l’expérimentation animale : les méthodes in vitro et in silico (substitution absolue) et les méthodes ex vivo (substitution relative).
La liste des techniques décrites ci-dessous ne prétend pas être exhaustive, elle fait un état des lieux des principales approches de substitution à l’expérimentation animale.
Les méthodes in silico et in vitro couvrent :
— Les méthodes QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) ou systè- mes experts permettant de modéliser les résultats obtenus de bases de données in vivo / in vitro , — Les méthodes physico-chimiques, (ex : le « direct peptide reactivity assay (DPRA) » pour prédire un potentiel sensibilisant, le dosage par CLHP a en remplacement des bio-essais pour le titrage et le contrôle de la qualité des protéines recombinantes à usage thérapeutique), — Les systèmes reconstitués, utilisant des récepteurs ou enzymes purifiés, (ex : les systèmes cytochromes P450 reconstitués pour identifier une voie de métabolisation), — Les techniques de biologie moléculaire à haut débit, appelées aussi « Omiques », — Les méthodes utilisant de bactéries (ex : Test d’Ames), — Les cultures cellulaires (lignées ou cultures primaires), — Les tissus reconstitués (ex : peau et cornée humaines, épithélium alvéolaire), Il est important de noter que malgré les progrès réalisés pour développer des modèles cellulaires capables de conserver un bon niveau de différenciation ou reconstituer des organes (ex : la peau), ces méthodes présentent encore des limites à leur utilisation en méthode unique de remplacement de l’animal. Ces limites tiennent à la simplification des systèmes biologiques qui ne permet pas de simuler la complexité des réactions survenant dans un organisme entier.
a CLHP : Chromatographie Liquide à Haute Performance
Les domaines d’utilisation des méthodes substitutives à l’expérimentation animale
Il existe quatre grands domaines d’utilisation des méthodes substitutives :
— La recherche : fondamentale dans le secteur public et la recherche et le développement de médicaments humain ou vétérinaire dans le secteur privé, — La toxicologie pour l’évaluation des risques de toute substance, à visée thérapeutique ou non, — Le contrôle des produits de santé et des denrées alimentaires, — L’enseignement.
Les méthodes alternatives ne sont pas soumises aux mêmes contraintes selon le contexte de leur utilisation :
— La recherche fondamentale développe et utilise les outils de substitution principalement en complément de l’expérimentation animale comme une aide à la compréhension des mécanismes biologiques (étude des pathologies, des comportements…). Dans ce cas, les méthodes substitutives sont utilisées librement, sans contrainte de validation préalable.
— La toxicologie et le contrôle de la qualité des produits répondent à des exigences réglementaires beaucoup plus contraignantes dans la mesure où une méthode requise par les textes réglementaires doit être validée afin d’apporter la preuve de sa pertinence, de sa capacité à détecter les effets observés chez l’animal ou chez l’homme et de sa reproductibilité.
Les validations sont essentiellement menées au niveau européen par l’ECVAM a pour les substances chimiques (lignes directrices de l’OCDE), l’EDQM b pour le médicament (monographies de la pharmacopée européenne). Il faut souligner deux aspects majeurs qui sont un frein à l’utilisation pratique des méthodes substitutives, d’une part la durée (> 10 ans) et le coût (200 000 k/étude) des études de validation.
On peut noter des différences selon les réglementations. Le règlement REACh c autorise l’utilisation d’une méthode substitutive non validée mais dont la preuve de la pertinence scientifique est apportée. En revanche, pour le secteur cosmétique ou pour le contrôle de la qualité, d’un vaccin par exemple, la validation par la mise en œuvre d’une étude formalisée est exigée par les autorités réglementaires.
Les étapes du processus de validation défini par l’ECVAM sont :
— Le développement de la méthode — La pré-validation — La validation — L’examen par les pairs (comité scientifique) — L’adoption réglementaire a ECVAM : European Centre for the Validation of Alternative Methods b EDQM : European Directorate for The Quality of Medicine ou Direction Européenne de la Qualité du médicament et soins de santé c REACh : enRegistrement, Evaluation et Autorisation des substances Chimiques
Il faut souligner qu’à ce jour peu de méthodes substitutives sont validées et réglementairement adoptées (tableaux 1 et 2). De plus, ces méthodes sont quelquefois pas ou peu utilisées après leur adoption réglementaire. Il existe plusieurs explications à cela : le processus de validation tel que défini par l’ECVAM est long et couteux.
L’absence des autorités réglementaires dans le choix des méthodes soumises aux études de validation aboutit quelquefois à la validation de méthodes qui ne sont pas reconnues au niveau international et de ce fait ne sont pas utilisées par les industriels pour lesquels la réalité du marché est internationale. Un partenariat européen EPAA d entre la Commission européenne et sept secteurs industriels mis en place en 2005 a pour objectif d’améliorer l’efficacité et la pertinence des choix des études de validation.
Tableau 1. — Bilan des méthodes substitutives réglementaires appliquées aux substances chimiques (dont les ingrédients des produits cosmétiques). Ces méthodes font l’objet de Lignes Directrices (Test Guidelines, TG), identifiées par un code international par l’OCDE.
Propriété étudiée
Méthode(s) substitutive(s)
Modèle utilisé
Mutagénèse 1. Essai de mutation reverse (TG OCDE 471) 1. Bactéries 2. Essai de mutation génique (TG OCDE 481) 2. Bactéries 3. Essai d’aberration chromosomique in vitro (TG 3. Cellules
OCDE 473) 4. Essai in vitro de mutation génique (TG OCDE 476) 4. Cellules 5. Essai in vitro d’échange de chromatides sœurs (TG 5. Cellules
OCDE 479) 6. Cellules 6. Essai des micronoyaux sur cellules (draft OCDE 487) Corrosion cutanée 1. Essai de résistance électrique transcutanée (TG 1. Explant de peau OCDE 430) de rat 2. Essai sur modèle de peau humaine (TG OCDE 2. Epiderme 3D 431) 3. Méthode d’essai in vitro sur membrane (TG OCDE 3. Membrane 435) acellulaire Absorption cutanée Méthode in vitro (TG OCDE 428)
Explant de peau (humaine et de rat ex-vivo )
Photo-toxicité
Essai de photo-toxicité 3T3 NRU (TG OCDE 432) Lignée cellulaire Irritation cutanée
En cours d’adoption à l’OCDE Epiderme 3D Irritation oculaire
Méthode ex vivo — BCOP a (TG OECD 437)
Cornée bovine Méthode ex vivo — ICE b (TG OECD 438)
Œil isolé de poulet d EPAA : European Partnership for Alternative Approaches a BCOP : Bovine Cornea Opacity Permeability b ICE : Isolated Chicken Eye
Tableau 2. — Bilan des méthodes substitutives réglementaires appliquées au contrôle de la qualité des médicaments d’origine biologique, vaccins, biotechnologies, sérums, toxines (Monographies de la Pharmacopée européenne) [5].
Méthode substitutive
Remplacement de :
Produits concernés
Vaccins humains Produits sanguins Test de recherche d’endotoxines
Test d’apyrogénicité chez le lapin Produits biotechnologies bactériennes (LAL) (2.6.14)*
(2.6.8) Antibiotiques Radiopharmaceutiques Toxicité générale : Suppression de Toxicité anormale chez la souris et Vaccins humains et tests inutiles si preuve apportée de le cobaye (2.6.9 et Monographie vétérinaires la régularité de la production générale 0062) Produits sanguins Test de recherche de substances Produits biotechnologies • Histaminiques (2.6.8) Antibiotiques • Hypotensives (2.6.11) Test d’absence de toxicité et d’irré- Tests de sécurité :
versibilité de la toxine diphtérique chez le cobaye (Monographie générale 0443) Test de toxicité sur culture cellu- Test de toxicité spécifique tétani- Vaccins humains laire que et diphtérique sur cobaye Suppression de tests inutiles si Test d’immunogénicité sur souris preuve apportée de la régularité de du vaccin polysaccharidique production conjugué Haemophilus influenzae Tests d’activité* :
1. Quantification des antigènes 1. Test sérologique d’activité du vaccin contre la poliomyélite (inactivé) chez le rat Vaccins humains 2. Test de contrôle d’activité du 2. Test de contrôle d’activité du vaccin antivariolique sur culvaccin antivariolique sur œufs ture cellulaire Hormones (somatotropine, insuline, Dosages physicochimiques
Bio-essais chez la souris desmopressine, (CLHP) calicitonine, oxytocine, tétracostactide Vaccins Hépatites A et B Dosage de l’Antigène par ELISA Tests sérologiques
Vaccin vétérinaire dans le vaccin*
« New Castle Disease » * Sous réserve de validation par le laboratoire désirant remplacer le test in vivo par le test in vitro
La place des méthodes substitutives dans les stratégies de réduction de l’expérimentation animale :
La recherche et le développement d’un nouveau médicament [6]
Les méthodes substitutives sont utilisées depuis de nombreuses années par l’industrie pharmaceutique à tous les niveaux du développement d’un médicament, particulièrement lorsqu’il s’agit de mettre en évidence les mécanismes d’action et d’orienter le choix de l’espèce non-rongeur qui sera requise pour les tests toxicologiques. On peut citer les fractions microsomales hépatiques et les cultures d’hépatocytes humains ou d’origine animale utilisées pour étudier le métabolisme, le potentiel inhibiteur/inducteur enzymatique(2). L’utilisation des cellules Caco2 comme modèle de barrière intestinal [7].
L’évaluation des risques d’une substance chimique
L’une des stratégies proposées aujourd’hui pour réduire le nombre d’animaux utilisés en toxicologie prédictive dans le cadre de la nouvelle réglementation europé- enne pour les substances chimiques, est d’effectuer l’évaluation des risques toxiques sur les résultats d’une série de tests, dans un ordre croissant de complexité, en commençant par les tests substitutifs. Une stratégie de tests intégrés correspond à un enchaînement de tests avec un prise de décision à chaque étape de type « arrêt » ou « poursuite à chaque étape ». Cette prise de décision repose sur le résultat du test (réponse positive ou négative). La stratégie de tests intégrés est mise en œuvre uniquement lorsque les données existantes ne permettent pas de conclure à une classe de toxicité.
Exemple de stratégie de tests intégrés ou ITS: irritation/corrosion cutanée, Ligne directrice
TG/OCDE 404, REACh Étape 1 :
Utiliser les sources d’informations existantes, Données existantes — Propriétés physico-chimiques — Données humaines existantes — Données existantes sur l’animal sur irritation/corrosion — Études de toxicité générale existantes — QSARs, lectures croisées « Read-Across » — Données in vitro existantes
Étape 2 :
Pertinence et fiabilité des informations obtenues à l’étape 1 pour Le « Poids de l’évidence » « C&L/DNEL, — Oui : pas de test requis, conduire l’évaluation des risques — Non : pas de preuves suffisantes → Étape 3 Étape 3 :
Réaliser de nouveaux tests in-vitro ou ex-vivo pour évaluer la corrosion
Nouveaux tests (TG OCDE), — Si substance corrosive → Classement/Étiquetage — Si substance non corrosive → poursuite des tests Générer de nouvelles données in-vitro pour évaluer l’irritation, — Si données suffisantes → Classement/Etiquetage — Sinon, poursuite des tests Générer de nouvelles données in-vivo pour évaluer l’irritation
C&L : Classification & labelling DNEL a : Derived no effect level.
a DNEL : Dose ou concentration d’exposition au-dessus de laquelle les populations humaines ne devraient pas être exposées.
Création d’une plate-forme française dédiée aux méthodes alternatives [8]
Un Groupement d’Intérêt Scientifique, GIS nommé « plateforme française pour le développement des méthodes alternatives en expérimentation animale », a été créé en novembre 2007 afin de fédérer l’ensemble des acteurs nationaux agissant dans le domaine des méthodes alternatives en expérimentation animale.
Ce GIS, abrité par l’Afssaps, est dorénavant intégré dans le réseau des plateformes européennes, au nombre de seize, dédiées aux méthodes alternatives dont les activités sont coordonnées par la plateforme européenne ECOPA b.
Ce GIS a annoncé dans son programme de travail la mise en œuvre d’action afin de promouvoir les méthodes qui appliquent le concept de ‘‘3R’’.
Les premiers travaux de la plate-forme française ont consisté à faire un état des lieux du développement et de l’utilisation des méthodes substitutives en France à la demande de Madame la Ministre de l’Enseignement supérieur et de la Recherche (fin 2009).
CONCLUSION
Les méthodes substitutives sont des outils pertinents qui contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés en expérimentation mais également à améliorer la prédictivité des effets chez l’homme. Cependant, les recherches publique et privée sont confrontées à de nouvelles problématiques.
Les réglementations sont plus contraignantes vis-à-vis de l’expérimentation animale, les directives couvrant la protection animale mais aussi la directive relative aux produits cosmétiques et le règlement REACh imposent de disposer le plus rapidement possible d’outils alternatifs validés. Ces contraintes posent la question particulièrement préoccupante de la disponibilité de méthodes substitutives pour l’étude des toxicités chroniques ou répétées comme la reprotoxicité ou la toxicocinétique, mettant en jeu des mécanismes biologiques trop complexes pour envisager à court terme le remplacement total de l’animal.
La pharmacologie et la toxicologie doivent s’adapter à l’innovation que ce soit en termes d’outils disponibles pour la mise en œuvre des études ou de produits mis sur le marché : les nouveaux outils utilisés en approches intégrées pour les substances chimiques ou en phase préclinique pour le médicament permettent d’éviter l’utilisation inutile de l’animal et souvent d’améliorer la prédictivité du modèle animal.
La question de la pertinence des modèles de toxicologie conventionnelle se pose pour les produits innovants comme les thérapies innovantes (thérapies génique et cellulaire, ingénierie cellulaire), les biotechnologies (protéines recombinantes, anticorps monoclonaux) et les nanotechnologies (nanomédicaments, cosmétiques, produits chimiques). Les efforts doivent porter sur une utilisation adaptée des noub European Consensus Platform for Alternatives veaux outils disponibles et la recherche de biomarqueurs pertinents aussi bien in vivo qu’ in vitro pour évaluer ces nouveaux produits. Les omiques ainsi que les méthodes de dosage multiplex adaptées aussi bien à la cellule qu’a l’animal sont des outils de choix pour la recherche de ces biomarqueurs. Enfin, la pharmacotoxicologie moderne devient multidisciplinaire, elle fait dorénavant appel à la biologie in vivo / in vitro , la bioinformatique, les mathématiques pour la modélisation. Il conviendra dans le futur d’encourager la concertation entre les différentes disciplines s’il l’on veut relever les défis de la science de demain. Enfin, la France s’est dotée d’une plate-forme dédiée aux méthodes alternatives qui jouera un rôle clef dans le futur pour le développement et la promotion des méthodes substitutives à l’expérimentation animale.
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