Communication scientifique
Séance du 27 avril 2004

Le système rénine-angiotensine dans le cerveau humain et les tumeurs cérébrales : une fonction autre que la régulation de la pression ?

The renin-angiotensin system in human brain and brain tumors : a function unrelated to blood pressure control ?
KEY-WORDS : apoptosis. blood-brain-barrier.. brain. permeability. renin-angiotensin system

Lucienne Juillerat-Jeanneret *, Jean-Marie Gasc **, Pierre Corvol **

Résumé

Le système rénine-angiotensine (RAS), en plus du contrôle de la pression sanguine et de la balance hydro-sodée, peut être impliqué dans la croissance et/ou la survie cellulaire. Afin d’évaluer cette possibilité, nous avons comparé l’expression des composants du RAS sur des pièces opératoires de tumeurs cérébrales humaines et du tissu adjacent. Des cellules de tumeurs cérébrales humaines ou de cerveau de rat en culture ont permis d’évaluer les fonctions du RAS. De ces expériences, il ressort que le RAS pourrait être impliqué dans le maintien des fonctions du système vasculaire cérébral (la barrière hémato-encéphalique), en contrôlant le rapport entre angiotensine II/angiotensine III, et plus directement dans la survie des cellules astrogliales. M OTS-CLÉS : SYSTÈME RÉNINE-ANGIOTENSINE. ENCÉPHALE. APOPTOSE. PERMÉABILITÉ. BARRIÈRE HÉMATOENCÉPHALIQUE.

Summary

The renin-angiotensin system (RAS), in addition to controlling blood pressure and the sodium-water balance, may be involved in cell growth and/or death in the brain. In order to address this issue, we compared the expression of RAS components in surgical specimens of human brain tumors and adjacent tissue. Human brain tumor cells and rat brain cells in culture were used to evaluate RAS functions. We found evidence that the RAS may be involved in maintaining the functions of the cerebral vasculature (the blood-brain-barrier) by controlling the ratio between angiotensin II and angiotensin III production, and by playing a more direct role in the survival of astroglial cells.

Le système rénine-angiotensine dans le cerveau humain et les tumeurs cérébrales :

une fonction autre que la régulation de la pression ?

The renin-angiotensin system in human brain and brain tumors :

a function unrelated to blood pressure control ?

Lucienne JUILLERAT-JEANNERET *, Jean-Marie GASC **, et Pierre CORVOL **

INTRODUCTION

Le système rénine-angiotensine (RAS) se compose d’un précurseur protéique, l’angiotensinogène (AGT), sur lequel agissent de façon séquentielle des enzymes protéolytiques qui vont produire une famille d’hormones vasoactives, les angiotensines, qui interagissent avec une famille de récepteurs à 7 domaines transmembranaires liés aux protéines G, (AT1 et AT2). L’AGT est l’unique substrat connu d’une protéase, la rénine (EC 3.4.23.15), produisant l’angiotensine (Ang) I, inactive, qui est convertie en l’hormone représentative du système, l’Ang II, par l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA) (EC 3.4.15.1) par élimination d’un dipeptide C-terminal. Alternativement, les angiotensines peuvent être métabolisées par une prolyl-carboxypeptidase (EC 3.4.21.26) en Ang 1-7 ayant des actions biologiques distinctes [1]. L’élimination séquentielle des acides aminés en position N-terminale, d’abord par l’aminopeptidase A (EC 3.4.11.7), va produire une hormone active, l’Ang III, puis par des aminopeptidases B/N, l’Ang IV, agissant sur d’autres récepteurs [2], et finalement des fragments inactifs. Le RAS est exprimé indépendamment du système circulant dans différents tissus non-vasculaires, incluant le système nerveux central (SNC) [3, 4]. Dans le SNC, le rôle du RAS inclut non seulement la régulation des fonctions cardiovasculaires [5], mais peut aussi contrô- ler la croissance ou la mort cellulaire [6, 7]. Le but des études que nous avons entreprises consiste à comparer les différences d’expression du RAS dans du tissu et des cellules de SNC normal et tumoral, afin de comprendre le rôle des divers composants du RAS dans les désordres liés aux tumeurs du SNC.

MÉTHODES

Tissus humains

Des tissus de résection chirurgicale thérapeutique ou à but diagnostique de tumeurs cérébrales ou de pathologies non-tumorales ont été rétrospectivement sélectionnés de la banque de tissus de l’Institut Universitaire de Pathologie de Lausanne. Ces tissus avaient été soit fixés dans du formol à 4 % et inclus en paraffine, soit congelés à —80° C. Les tissus inclus en paraffine ont été utilisés pour les études histologiques, immunohistologiques ou d’hybridisation in situ , alors que les tissus congelés ont été utilisés pour les études d’histoenzymographie, de RT-PCR ou de western blotting.

Des coupes histologiques déparaffinées ont été exposées aux anti-corps sélectifs contre l’angiotensinogène, la rénine, l’ECA, ou les sondes d’acides nucléiques préparées contre les ARNm de ces mêmes molécules. Les protocoles expérimentaux détaillés ont été décrits précédemment [8, 9]. Pour la détermination par histoenzymographie des activités des aminopeptidases A,B et N, des substrats sélectifs pour ces activités, couplés à la β-naphthylamine ont été ajoutés aux coupes histologiques congelées en présence de Fast Blue B, un précipité rouge localisant l’activité de l’enzyme étudié. Les modes opératoires expérimentaux détaillés ont été décrits précédemment [8].

Pour les expériences de RT-PCR et de western blotting, des fragments de tissu de SNC ont été extraits soit dans du Trizol, soit dans un tampon contenant un détergent, et les extraits ont été soumis aux procoles d’amplification ou d’électrophorèse, comme décrit en détail précédemment [8, 9].

Expériences en culture cellulaire

Des cultures cellulaires permanentes ont été obtenues à partir de pièces de résection chirurgicale de glioblastomes humains [10]. Les cultures obtenues ont été exposées aux modulateurs du RAS : AGT, inhibiteurs de la rénine, inhibiteurs de l’ECA, ou des peptides de la famille des angiotensines, et soit la croissance cellulaire, soit la mort cellulaire par apoptose ont été évaluées. Les protocoles expérimentaux détaillés ont été décrits précédemment [9,11,12].

Pour l’étude de la régulation de l’aminopeptidase A, un modèle expérimental chez le rat a été utilisé. Les cellules endothéliales cérébrales de rat ont été obtenues par sélection après implantation stéréotactique de cellules endothéliales immortalisées dans un animal syngénique [13]. Pour l’étude de la régulation in vivo de l’activité aminopeptidase A, un inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine a été donné pendant 20 jours aux animaux portant un glioblastome expérimental dans le cerveau [8]. Un modèle expérimental de culture tri-dimensionnelle de cellules céré- brales différenciées enrichies en microvaisseaux cérébraux et exposées à des facteurs sécrétés par des cellules de glioblastomes de rat a également été utilisé pour évaluer la régulation de l’aminopeptidase A [14]. Les protocoles expérimentaux détaillés ont été décrits précédemment.

RESULTATS ET CONCLUSIONS

Le RAS joue le rôle d’un système endocrine dans la circulation, et d’un système paracrine/autocrine dans les tissus. Dans la circulation, le peptide Ang II contrôle la pression sanguine et la balance électrolytique, par le biais de son récepteur AT1 [15].

En tant que système autocrine/paracrine, les peptides de la famille des angiotensines, formés localement, participent à ces mécanismes régulateurs, mais peuvent avoir d’autres actions, dépendant du contexte tissulaire, des expressions relatives des différentes protéases/peptidases impliquées dans leur métabolisme, et de l’expres-
sion sélective des divers récepteurs cellulaires pour ces peptides. Ces fonctions incluent un contrôle de la prolifération et mort cellulaire, y compris dans le système vasculaire [6,7,16,17]. Dans le SNC normal, l’expression de la rénine, de l’AGT, de l’ECA et du récepteur AT1 avait été démontrée précédemment, en utilisant du matériel provenant principalement de rongeurs [18-22]. Le schéma 1 résume l’expression connue des divers composants du RAS dans le SNC normal. Nous avons en premier lieu déterminé l’expression des composants du RAS dans le cerveau humain. Dans le cerveau normal, il avait été montré que ce sont principalement les astrocytes qui expriment l’AGT [3, 4], alors que la rénine est exprimée par certaines populations d’astrocytes, et surtout de neurones, incluant des populations de neurones localisés en différentes régions du SNC [5]. Utilisant du tissu de SNC humain, nous avons confirmé ces résultats, cependant nous avons également observé l’expression de rénine dans certaines populations de macrophages céré- braux. Il n’est cependant pas clair si la rénine produite dans le SNC normal est sécrétée par les cellules, comme c’est le cas pour les cellules juxtaglomérulaires du rein, alors que la sécrétion d’AGT par les astrocytes est acceptée, et pourrait contrôler l’angiogénèse [12]. L’ECA et le récepteur de type AT1 sont exprimés par le système vasculaire cérébral, correspondant aux observations obtenues dans les autres organes, et suggérant que dans le système vasculaire cérébral normal, les peptides du RAS jouent un rôle identique à celui connu pour les autres systèmes vasculaires. Dans le système vasculaire normal l’activité aminopeptidase A est faible et les activités aminopeptidases N et B sont détectables.

Dans les cancers du SNC, nous avons observé l’expression de l’AGT et de la rénine dans les cellules tumorales, confirmant des études précédentes [3,23], l’expression de l’AGT pourrait être diminuée dans les cellules tumorales astrocytaires comparées aux astrocytes non-tumoraux, cependant nous avons des évidences que l’AGT est toujours sécrété par les cellules tumorales. L’expression de la rénine est inhomogène dans les cellules tumorales, mais généralement élevée. Le système vasculaire des tumeurs cérébrales, en particulier pour les tumeurs de haut grade, est fortement anomal, élargi, présentant des structures gloméruloïdes, et ayant perdu les fonctions de barrière hémato-encéphalique, ce qui conduit à la formation d’un œdème. Nous avons observé que dans le système vasculaire tumoral cérébral, l’expression de l’ECA est élevée, et nous avons également observé une augmentation importante de l’activité de l’aminopeptidase A, alors que les activités des aminopeptidases B et N étaient très fortement diminuées. La Table 1 résume les différences d’expression des divers composants du RAS entre le tissu cérébral normal et tumoral.

Pour évaluer le rôle potentiel des divers composants du RAS dans le SNC humain tumoral, et par comparaison, dans le SNC humain normal, nous avons utilisé divers modèles in vitro de cultures cellulaires. Les composants initiateurs du RAS, soit l’AGT et la rénine, sont exprimés dans le parenchyme cérébral, par conséquent, nous avons déterminé leur rôle en utilisant des cellules issues de ce tissu. Des cellules humaines de tumeurs cérébrales (gliobastomes), ont été évaluées pour leur expression des composants du RAS. Ces cellules expriment l’AGT, la rénine et sélective-
ment les récepteurs AT2 et/ou AT1, cependant la rénine n’est pas sécrétée par ces cellules. Ces cellules ne réagissent pas, quant à leur croissance ou leur mort cellulaire, à l’addition d’AGT, et de divers peptides de la famille des angiotensines. Cependant quand ces cellules sont exposées à des inhibiteurs de la rénine (inhibiteurs de type pipéridine [24, 25]), une importante inhibition de croissance est observée, couplée à une induction d’apoptose [9]. Par conséquent, le RAS par l’intermédiaire de son enzyme rénine, mais pas de ses peptides de la famille des angiotensines, est un facteur de survie pour les cellules astrogliales. Ces informations sont cohérentes avec l’information que, par le biais de la liaison de Ang II sur son récepteur AT2, le RAS peut jouer un rôle protecteur dans le SNC [26, 27], protégeant les neurones et induisant la régénération axonale et la formation de neurites.

Les composants effecteurs du RAS, soit l’ECA et les différentes aminopeptidases, sont exprimés dans le système vasculaire cérébral, par conséquent, nous avons déterminé leur rôle en utilisant des modèles de ce tissu. Il avait été montré précé- demment par quelques groupes que les peptides vasoconstricteurs, y compris les angiotensines, contractent moins efficacement les vaisseaux des tumeurs que les vaisseaux normaux, suggérant un défaut dans le RAS dans les cancers. Notre observation d’une expression augmentée de l’ECA et de l’activité de l’aminopeptidase A, couplée à une activité diminuée des aminopeptidases B et N, suggère que dans les tumeurs cérébrales, la production d’Ang III est favorisée (voir Schéma 1 et Table 1). Pour étudier les mécanismes de régulation des ces enzymes, nous avons utilisé un modèle de culture tri-dimensionnelle de cerveau embryonnaire de rat, différencié in vitro , de vaisseaux cérébraux de rat et de cellules endothéliales et de glioblastome de rat. Les résultats ont montré que cette augmentation d’activité de l’aminopeptidase A est due à des facteurs solubles sécrétés par les cellules de glioblastomes, en normoxie aussi bien qu’en hypoxie. Cette augmentation de l’activité de l’aminopeptidase A est antagonisée par des molécules anti-inflammatoires, telles le TGF-β et les glucocorticoides, qui en contre-partie augmentent l’expression de l’ECA [28]. Cette activité aminopeptidase A n’est pas liée à la prolifération vasculaire observée dans les tumeurs cérébrales, mais probablement à la perte de fonction de barrière hémato-encéphalique observée dans le système vasculaire des tumeurs cérébrales. Ces observations sont cohérentes avec l’observation que chez des souris invalidées pour le gène de l’AGT, on observe une perte de la fonction de la barrière hémato-encéphalique, qui peut être compensée par l’administration de Ang II et Ang IV, mais pas Ang III [6, 7], soulignant l’effet délétère de ce dernier peptide pour les fonctions du système vasculaire cérébral.

En résumé, nos résultats montrent que le système rénine-angiotensine est impliqué dans les fonctions du SNC à plusieurs niveaux et impliquant différents types cellulaires. Ces fonctions ne sont pas liées aux fonctions du système RAS circulant, telles la régulation de la balance hydrosodée ou de la pression sanguine. Dans le SNC, le RAS peut jouer : le rôle d’un facteur de survie cellulaire, n’impliquant pas obligatoirement la production extracellulaire d’angiotensines ou la liaison des angiotensines sur leurs récepteurs cellulaires membranaires, ou de régulateur des

SCHÉMA 1. — Expression des peptides et des enzymes du RAS dans le cerveau humain ou de rongeur normal.

angiotensinogène (astrocytes et quelques populations de neurones) rénine (astrocytes et neurones) angiotensine I Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu ↓ ECA (système vasculaire) angiotensine II → AT 1/2

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe → Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro ↓ aminopeptidase A (système vasculaire) angiotensine III → AT 1/2

Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe ↓ aminopeptidase B (système vasculaire) angiotensine IV → AT 4

Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe ↓ aminopeptidase N (système vasculaire) inactifs fragments TABLE 1. — Comparaison des expressions des composants du RAS dans le cerveau humain normal et tumoral.

normal tumoral différences angiotensinogène (astrocytes) ++ + ↓ → ↓ rénine (astrocytes et neurones) + ++ ↑ angiotensine I ↓ ECA (système vasculaire) + ++ ↑↑ angiotensine II ↓ ↓ aminopeptidase A (système vasculaire) + +++ ↑↑↑ angiotensine III ↑ ↓ aminopeptidase B (système vasculaire) + – ↓ angiotensine IV ↓ aminopeptidase N (système vasculaire) + – ↓ inactifs fragments ↓ : expression diminuée ; ↑ : expression augmentée ; → : expression non-modifiée + : exprimé ; — absent
fonctions de la barrière hémato-encéphalique, par le biais d’une production diffé- rentielle d’Ang III.

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DISCUSSION

M. Jacques-Louis BINET

Avez-vous observé chez les patients, dont vous avez étudié les glioblastomes et les autres tumeurs cérébrales, une polyglobulie associée ?

Cette question n’a pas du tout été examinée, mais il serait possible si nécessaire, de contrôler cette information dans les dossiers des patients.

M. Bernard PESSAC

Quelle est la localisation cellulaire et ultrastructurale des aminopeptidases A et B/N dans les vaisseaux normaux et ceux des tumeurs cérébrales ?

Dans nos évaluations utilisant une approche qui met en évidence l’activité enzymatique à la surface cellulaire (et non la présence d’un antigène), les activités aminopeptidases B/N sont faibles dans les vaisseaux dans les zônes péri-tumorales, et non-mesurables dans les zônes tumorales. Alors que l’activité de l’aminopeptidase A est faible dans les vaisseaux non-tumoraux, et très élevée à la surface des cellules forment la lumière des vaisseaux anormaux associés aux cancers. Le type cellulaire exprimant cette activité dans les vaisseaux tumoraux est difficile à déterminer avec certitude. La localisation à la surface du lumen de ces vaisseaux, l’expression de l’enzyme de conversion de l’angiotensine et d’autres marqueurs endothéliaux suggèrent que ce sont des cellules endothéliales.

Cependant, l’expression de marqueurs tels l’α-actine musculaire lisse suggère un type cellulaire péricytaire/myofibroblastique/musculaire lisse. En culture cellulaire, une lignée de type endothélial obtenue dans un modèle de tumeur cérébrale induite chez le rat, et exprimant les marqueurs des cellules endothéliales cérébrales exprime une quantité élevée d’activité aminopeptidase A à la surface cellulaire, ce qui me ferait proposer que ce sont bien, mais peut-être pas exclusivement, des cellules endothéliales, qui expriment cette activité dans les cellules formant la lumière des vaisseaux tumoraux.

M. Bernard LECHEVALIER

Avez-vous réussi à établir un rapport entre le degré de vascularisation des glioblastomes et l’expression de la rénine, de l’angiotensine ou de l’enzyme de conversion dans ces tumeurs ?

Un rapport entre ces composants et le degré de malignité des astrocytomes ? Avez-vous étudié des tumeurs vasculaires comme les cavernomes et les hémangioblastomes ?

L’expression de la rénine, et en partie aussi de l’angiotensiogène, est très inhomogène dans les glioblastomes, présentant des zônes positives voisinant avec des zônes négatives.

Le nombre d’échantillons examinés jusqu’à maintenant ne permet pas une certitude, mais nous avons l’impression que l’expression de l’angiotensinogène est inversement reliée à la vascularisation anormale des tumeurs, et à leur degré de malignité. Cependant cette information a besoin d’être soutenue par des études complémentaires sur un plus
grand nombre d’échantillons. L’enzyme de conversion de l’angiotensine est généralement et uniquement exprimé dans les vaisseaux tumoraux, et sans relation avec le degré de malignité. Nous n’avons pas examiné de cavernomes ou hémangioblastomes.

M. Michel ARTHUIS

Avez-vous une explication pour les glioblastomes familiaux chez les enfants de moins de 15 ans ?

Je n’ai jamais étudié de glioblastomes chez l’enfant.

M. Gabriel BLANCHER

Avez-vous observé les mêmes rapports entre système rénine-angiotensine et prolifération tumorale dans des tumeurs d’autres organes que le cerveau ?

Nous avons commencé à examiner d’autres tumeurs, en particulier les cancers du sein, du colon, du poumon et du foie, donc des carcinomes, ainsi que des mélanomes. Les études ne sont pas complétées, et ce ne sont encore que des résultats préliminaires et incomplets.

Ce que je peux dire est que l’angiotensinogène semble être exprimé fréquemment en culture dans les lignées cellulaires de ces tumeurs, les récepteurs à l’angiotensine et la rénine plus ponctuellement, et la rénine pourrait même être diminuée par dosage immunohistochimique sur des coupes histologiques dans certains cancers. Nous n’avons pas encore évalué l’effet de l’inhibition de la rénine dans les cellules qui l’expriment, ni l’effet des antagonistes aux récepteurs de l’angiotensine.


* Institut Universitaire de Pathologie, CHUV, 25, rue du Bugnon, CH1011 Lausanne, Suisse ** INSERM U36, Collège de France, 10, place M Berthelot, F75005, Paris, France. Tirés-à-part : Dr L. JUILLERAT, à l’adresse ci-dessus. Article reçu le 25 mars 2004 et accepté le 5 avril 2004.

Bull. Acad. Natle Méd., 2004, 188, no 4, 639-648, séance du 27 avril 2004