INTRODUCTION

Le rôle des ultraviolets (UV) dans la genèse des carcinomes cutanés est clairement établi [1] sur des arguments cliniques, épidémiologiques et expérimentaux. Dans le déterminisme des mélanomes, le rôle des expositions solaires est moins directement évident car d’une part le nombre total d’expositions importe moins que la nature de celles-ci et d’autre part des facteurs de susceptibilité génétique autres que le phototype semblent avoir un rôle prépondérant.

Les UVB (300-320 nanomètres), principales radiations impliquées dans l’érythème solaire, ont longtemps été tenus pour responsables de tous les dommages cutanés UV-induits [2]. Cette conception avait pour corollaire direct de ne conseiller une protection que contre ces seules radiations. Les photoprotecteurs externes, particulièrement efficaces pour prévenir l’érythème solaire, sont de ce fait devenus la base de la photoprotection artificielle.

Les études les plus récentes, conduites tant in vitro que chez l’animal et chez l’homme ont montré que les UVA (320-400 nm) et plus particulièrement les plus longs d’entre eux qualifiés d’UVA1 (340-400 nm) pouvaient être à l’origine des mêmes effets moléculaires, cellulaires et biologiques que les UVB. Les doses lumineuses nécessaires sont certes très supérieures mais l’efficacité spectrale dépend de l’effet biologique.

Les UVA1 sont ainsi 1 000 fois moins générateurs d’érythème que les UVB, en revanche leur efficacité pour induire des carcinomes expérimentaux chez la souris n’est que 100 fois moindre [3]. Compte tenu de la quantité relative d’UVB et d’UVA reçue au cours d’une journée, on peut ainsi admettre qu’en exposition naturelle les UVA participent seulement pour 10 à 15 % au déclenchement de l’érythème mais que cette participation pourrait atteindre 35 % pour l’induction des carcinomes cutanés [2].

Le modèle expérimental du xiphophorus hybride a en outre montré un rôle important voire prépondérant des UVA1 dans l’apparition des mélanomes [4].

Les mécanismes moléculaires à l’origine des effets cellulaires des UV sont enfin mieux appréhendés.

Outre une action directe sur certains chromophores cellulaires, principalement l’ADN, les UV génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ERO) et induisent par là même un intense stress oxydatif dans la cellule [5].

Les ERO sont de puissants agresseurs des structures biologiques. Dans la cellule elles causent des altérations de l’ADN, des membranes cellulaires et des protéines.

Ces altérations perturbent gravement les fonctions cellulaires et les ERO sont considérées comme fortement impliquées dans la cancérogenèse [6].

Les cellules sont équipées d’une défense antioxydante complexe pour s’opposer au stress oxydatif. La capacité de ces systèmes n’est cependant pas illimitée ; elle est dépassée par une surproduction d’ERO telle que celle déclenchée par une exposition
excessive aux UV. Il est dès lors logique d’envisager une stratégie de photoprotection basée sur l’amélioration de l’efficacité de la défense antioxydante intracellulaire, plus particulièrement pour prévenir la survenue des cancers cutanés.

Nos travaux expérimentaux ont consisté à évaluer au sein de la cellule l’effet protecteur de trois acteurs majeurs de la défense antioxydante endogène, les dérivés thiols, le zinc et le sélénium, contre les dommages oxydatifs générés par l’exposition UV.

Pour cela, nous avons irradié des cultures de cellules cutanées, analysé l’effet cytotoxique et les altérations des membranes cellulaires et de l’ADN occasionnés par ces irradiations, recherché les conséquences d’une déplétion du milieu de survie des cellules en zinc et à l’inverse évalué la protection éventuelle procurée par un apport supplémentaire au milieu de survie de zinc, de sélénium ou de dérivés thiols.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Culture cellulaire

Les cellules cutanées en culture constituent un modèle simple pour analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires liés à l’interaction entre les UV et un organisme vivant.

Ont ainsi étaient utilisés selon les expériences :

— des fibroblastes cutanés humains en culture issus d’excédents de peau provenant de donneurs sains adultes ayant subi une plastie mammaire ;

— des cellules HaCat, kératinocytes issus d’un implant de peau humaine adulte spontanément immortalisée in vitro .

Les cellules sont cultivées sur milieu RPMI-1640 contenant NaHCo et additionné 3 de 10 % de sérum de veau fœtal (ATG-C biotechnologie — Noisy-le-Grand — France). Le milieu est changé 48 heures avant les irradiations.

Selon les expériences, les milieux ont été additionnés de zinc, de sélénium ou de composés thiols ou à l’inverse les cellules ont été dépourvues en zinc par l’utilisation d’un chélateur diffusible du zinc, le NNN’ N’-tetrakis(2-pyridylmethyl) éthylène diamine (TPEN).

Nous avons analysé la viabilité cellulaire, les dommages à l’ADN, la péroxydation lipidique pour les cellules non irradiées et non supplémentées (ni dépourvues), les cellules non irradiées mais supplémentées (ou déplétées), les cellules irradiées et supplémentées (ou dépourvues). Les résultats de ces différentes analyses ont été comparés et soumis à une analyse statistique.

Irradiations

Les irradiations en spectre solaire total ont été réalisées au moyen d’un simulateur solaire Dermolum (Muller GmbH Elektronik — Optik — Allemagne). Le spectre d’émission de cet appareillage est adapté par l’adjonction de filtres de manière à reproduire fidèlement le spectre lumineux naturel.

Pour les irradiations UVA, une lampe haute pression (Tecimax — Verre et Quartz — Dixwell France ou UVAsun Mutzhas — Allemagne) émettant électivement dans l’UVA1 (340 à 450 nm avec une émission maximale à 365 nm) a été utilisée.

Enfin les irradiations UVB ont été faites avec un appareil Biotronic (VilbertLourmat — France) équipé de tubes fluorescents de 40 watts émettant entre 280 et 320 nm avec un pic d’émission à 312 nm.

Les doses lumineuses reçues par les cellules ont été mesurées à chaque expérience avec un photomètre calibré.

Techniques d’analyse

Mesures de viabilité des cellules

La viabilité cellulaire a été évaluée :

— par la méthode colorimétrique au tétrazolinum (dit méthode au MTT) décrite par Mossman [7] ;

— par la mesure de la capacité d’adhérence-prolifération. Le nombre de cellules adhérentes est déterminé par dosage des protéines cellulaires totales selon la méthode de Shopsis et MacKay [8] ; les résultats sont exprimés en pourcentage de survie ou de cytotoxicité par rapport aux cellules non irradiées.

Peroxydation lipidique

Les lipides insaturés, constituants principaux de la membrane cellulaire, sont une cible préférentielle de l’attaque radicalaire en raison de la présence de leur double liaison. Sous l’effet initiateur d’une ERO, ces lipides insaturés subissent une cascade de réactions radicalaires connue sous le nom de péroxydation lipidique. La phase finale est la formation de produits stables qui sont des aldéhydes. Le malondialdé- hyde (MDA) est le produit final de cette oxydation lipidique le plus connu. Il est de ce fait le plus utilisé comme marqueur de la péroxydation lipidique. Sa mesure repose sur une technique fluorométrique qui utilise la réaction du MDA avec l’acide thiobarbiturique (TBA) (Sobioda Kit — Grenoble — France) [9]. En fait, cette réaction mesure en même temps que le MDA d’autres substances qui régissent avec le TBA et il est préférable de parler de mesure des TBARs (produits réactifs à la TBA) plutôt que de mesure du MDA.

Analyse des dommages photo-induits à l’ADN

Une cible biologique privilégiée pour les ERO est l’ADN qui subit des oxydations de bases, des pontages nucléobases-protéines, des ruptures de chaînes.

Détermination des cassures de brins de l’ADN

La perte de la configuration en double hélice de l’ADN peut servir à qualifier les altérations causées à l’ADN du type de celles que peut provoquer une exposition aux UV.

Les cassures de brins d’ADN (strand-breaks) constituent un dommage oxydatif typique ; elles sont préférentiellement induites par le radical hydroxyle et l’oxygène singulet [10].

Il a été démontré que les cassures de brins sont responsables d’une augmentation du déroulement de l’ADN ; le taux de déroulement de l’ADN peut dès lors être utilisé comme une mesure sensible des cassures de brins.

La détermination des strand breaks a donc été faite en utilisant la méthode décrite par Birnboim et Jevcak [11]. Cette méthode évalue le degré d’ADN en double brin par la mesure de la liaison à un colorant fluorescent, le bromure d’éthidium ; la mesure utilise un spectromètre à fluorescence. Les strand breaks sont détectés après exposition des lysats cellulaires à des solutions alcaline. Le pourcentage de DNA en double brin (D) est déterminé par l’équation % D = 100x F(p)-Fb)/ [F(t)-F(p)] où F(p) est la fluorescence de l’échantillon, F(t) la fluorescence maximale et F(b) la fluorescence basale.

Test des comètes

La technique dite des comètes ou « Single Cell Gel Electrophoresis » [12] permet de mettre en évidence les dommages de l’ADN au sein de la cellule entière.

Initialement décrite par Östling et Johanson [13], cette technique simple et rapide est basée sur les propriétés de migration de l’ADN dans un champs électrique. Après électrophorèse, l’ADN est visualisé au moyen d’un marqueur fluorescent spécifique, le bromure d’éthidium. L’application d’un traitement alcalin permet en outre de mettre en évidence non seulement les coupures simples et doubles brins de l’ADN mais aussi les sites alcali labiles, témoins d’un dégât oxydatif sur l’ADN [14].

Après le marquage fluorescent, l’image de l’électrophorèse est celle d’une « boule » pour un ADN intact. A l’inverse, lorsque la structure de l’ADN est altérée, l’image ressemble à une comète avec, derrière la « boule » d’ADN intact, un halo en forme de traînée. Ce halo est d’autant plus étiré que l’ADN a été altéré. L’analyse de 50 noyaux, choisis au hasard sur la préparation au moyen du logiciel Komet 3.0, permet de déterminer différents critères des dommages à l’ADN. Parmi ceux-ci, nous avons retenu le « tail moment », défini comme le produit entre le pourcentage d’ADN dans la queue de la comète et la distance qui sépare le milieu de la tête du milieu de la queue de la comète. L’ADN est d’autant plus endommagé que le tail moment a une valeur élevée.

RÉSULTATS

Protection contre la cytotoxicité des UV

Ces études ont été conduites sur fibroblastes humains en culture. L’évaluation de la cytotoxicité a été faite soit par le test au MTT [15] soit par la mesure de la capacité d’adhérence-prolifération [16-17].

L’addition de zinc au milieu de culture sous forme de chlorure de zinc (Zncl2) protège de la cytotoxicité des UVB [16]. Elle protège encore mieux de la cytotoxicité des UVA [16] surtout lors d’irradiations à hautes doses d’UVA1 [17]. L’irradiation des cellules par les UVA1 induit en effet un très fort effet cytotoxique ; l’apport supplémentaire aux cellules de ZnCl2 procure une protection contre cet effet cytotoxique avec une très haute significativité (p < 0,0001) [17].

L’apport de sélénium sous forme de sélénite de sodium au milieu de culture induit la synthèse de GPX et parallèlement augmente très significativement (p < 0,0001) la résistance cellulaire à la cytotoxicité des UVA1 [17].

L’apport de 3 donneurs de cystéine, N-acétyl-cystéine ou NAC, N-acétylhomocystéine-thiolactone ou CIT, L-2-oxothiazolidine-4-carboxylate ou OTC [15] entraîne une protection contre l’effet cytotoxique noté sur les cellules témoin non supplémentées lors d’une irradiation UVA1.

Cet effet protecteur est dose-dépendant et équivalent pour les trois produits lors d’irradiations à doses faible et moyenne (9 à 15 Joules/cm2). A forte dose d’UVA1 (20 J/cm2), il existe en revanche une différence d’efficacité puisque l’OTC augmente le taux de cellules survivantes d’un facteur 3, le CIT d’un facteur 2, la NAC d’un facteur 1,4 comparativement aux cellules-témoin irradiées et non supplémentées.

L’apport simultané au milieu de survie de NAC et de sélénium conduit à une remarquable augmentation de la protection par la NAC des fibroblastes humains contre l’irradiation UVA1 (p < 0,05) à toutes les doses d’irradiation. Le même effet synergique avec le sélénium est noté pour la CIT ; en revanche, il n’existe pas pour l’OCT.

Dans la même étude [15], il apparaît que l’apport de NAC ou de CIT augmente significativement le taux de glutathion réduit dans la cellule alors que l’OTC n’a pas cet effet inducteur.

Protection contre la peroxydation lipidique

Parallèlement à leur effet protecteur contre la cytotoxicité des UVA, le zinc et le sélénium protègent la cellule contre la peroxydation lipidique.

En effet, l’élévation du taux de Tbars mesurée dans le surnageant des fibroblastes humains irradiés par UVA1 et non supplémentés est réduite significativement (p =
0,05) par l’apport supplémentaire de sélénium au milieu de culture et très significativement (p = 0,008) par celui de zinc [17].

Protection contre les dommages à l’ADN

Les analyses des dégâts génomiques ont été faites immédiatement après l’irradiation et la cinétique de réparation spontanée après irradiation n’a pas été explorée dans les présents travaux.

Effet du zinc sur l’intégrité de l’ADN après irradiation UVB [18]

Des kératinocytes HaCat ont été soit privés de zinc par addition du TPEN au milieu de culture, soit au contraire supplémentés en chlorure de zinc avant d’être soumis à une irradiation UVB. Les dommages à l’ADN ont alors été évalués par la mesure des strand breaks.

Le traitement des cellules avec le TPEN majore le taux de dommages à l’ADN induits par les UVB alors qu’à l’inverse la supplémentation en Zncl2 réduit significativement l’élévation du taux de strand breaks induite par l’irradiation UVB.

Effet du zinc, du sélénium et de la NAC sur les dégâts à l’ADN induits par les UVA1 [19-20]

L’addition de Zncl2 au milieu de culture de fibroblastes humains réduit significativement le taux de Strand breaks induits par une irradiation UVA1 à une dose comparable à celle reçue lors d’une exposition solaire naturelle [19].

Les dommages causés à l’ADN par des doses croissantes d’UVA1 de 1 à 6 J/cm2 ainsi que l’éventuel effet protecteur procuré par la NAC, le sélénium et le zinc ont été analysés en utilisant le test des comètes [20].

Comparativement aux cellules témoin non irradiées, le tail moment augmente de 45 % pour une irradiation de 1 J/cm2 et de 89 % pour une irradiation à 6 J/cm2 dans les cellules non supplémentées (p < 0,01).

A l’inverse, pour des irradiations de 1 à 4 J/cm2, la NAC, le sélénium et le zinc réduisent de manière identique le tail moment montrant une efficacité significative (p < 0,01) contre les altérations UVA1 induites de l’ADN. Pour les doses plus élevées d’UVA1 (6 J/cm2) la protection offerte est globalement moins nette ; le sélénium et le zinc sont alors significativement plus performants (p < 0,01) que la NAC.

Il est à noter que dans cette étude, l’association NAC — n’est pas plus protectrice que le sélénium seul, contrairement à ce que nous avions constaté pour la cytotoxicité.

DISCUSSION

La surexposition à laquelle le mode de vie actuel soumet notre peau dépasse les capacités des moyens naturels de photoprotection. L’augmentation constante du nombre de carcinomes et de mélanomes en est une preuve évidente. Cette augmentation justifie une véritable stratégie de photoprotection.

Effets moléculaires des UV

Les connaissances sur les effets moléculaires des UV ont grandement progressé ces dernières années, en particulier ceux sur l’ADN cellulaire.

Les UV ont une action directe sur certains chromophores cellulaires. Sur l’ADN, cette action directe aboutit à la formation de photo produits, dimères cyclobutane de pyrimidine (CPD) et de photo produits 6-4 pyrimidine — pyrimidone (6-4 pp).

L’absence de réparation de ces lésions de l’ADN, qui sont le fait essentiellement des UVB, conduit à des mutations.

Les UV génèrent aussi des espèces réactives de l’oxygène (ERO) comme l’oxygène singulet ou l’anion superoxyde soit directement soit surtout par le biais de réactions de photosensibilisation impliquant des photosensibilisants endogènes tels les riboflavines, les bilirubines, la phaéomélanine et les dérivés porphyriniques. L’oxygène singulet et l’anion superoxyde sont ensuite convertis, par des mécanismes variés, en d’autres ERO (peroxyde d’hydrogène et radicaux hydroxyle). Ce processus chimique en cascade aggrave le stress oxydant.

Cette production d’ERO, certes induite également par les UVB, représente le mécanisme principal de l’action délétère des UVA qui n’occasionnent que peu de dégâts moléculaires directs comparativement aux UVB.

Les ERO provoquent des oxydations des bases, des pontages nucléobases-protéines et des ruptures de chaînes de l’ADN.

Elles sont également à l’origine d’une peroxydation lipidique pour la cellule qui se traduit par une modification de la fluidité et de la perméabilité des membranes ; de plus, les aldéhydes, produits finaux de la peroxydation lipidique, peuvent altérer l’ADN.

Enfin, les ERO oxydent les protéines, comme certains facteurs de transcription, modifiant leur activité fonctionnelle.

Le rôle de la défense antioxydante endogène faite d’enzymes (superoxyde dismutases, catalase peroxydases) et de piégeurs d’ERO (thiols, vitamines E et C, bétacarotène, oligo-éléments) est de maintenir le potentiel redox de la cellule lors d’un stress oxydatif.

Les dommages moléculaires induits par le stress oxydant bouleversent en effet gravement le fonctionnement cellulaire par altération des voies de transduction des
signaux [21], par modification de la transcription des gènes redox-sensibles [22], par induction de mutations.

Mécanismes de photocarcinogenèse

Les mécanismes intimes de la photocarcinogenèse sont mal élucidés [23-25]. Deux phénomènes paraissent intervenir de manière prépondérante : les mutations consé- cutives aux dommages à l’ADN, directs ou indirects par les ERO, et la photoimmunosuppression.

Les mutations induites sur les gènes suppresseurs de tumeurs ( p53 , CDKN2/p16ink4 ou PTCH ) paraissent les plus déterminantes.

L’immunosuppression induite par les UV, largement démontrée tant chez la souris que chez l’homme, en empêchant le rejet des cellules mutées paraît avoir un rôle central dans la promotion et la progression tumorales. La photo-immunosuppression est un phénomène particulièrement complexe. Les UVB semblent avoir un rôle prédominant, probablement par une action directe sur deux chromophores initiateurs, l’acide urocanique et l’ADN [25]. Cependant, les UVA participent par une stimulation de la production de cytokines immunosuppressives telle l’interleukine 10 (Il10) sous l’effet des ERO [26].

Ces notions laissent percevoir la place que peuvent avoir les ERO produites lors de l’exposition UV dans la photocarcinogenèse et l’intérêt de contrôler cette surproduction d’ERO avant qu’elle n’ait des conséquences cellulaires irréversibles.

Comment protéger contre les cancers photo-induits

La stratégie la plus simple de photoprotection est d’empêcher la pénétration du rayonnement jusqu’aux cibles vitales de la cellule de manière passive par les vêtements ou les produits antisolaires.

Les photoprotecteurs externes sous formes de filtres ou d’écrans solaires sont très efficaces pour protéger contre les effets aigus du soleil. Leur potentiel protecteur contre les cancers est en revanche plus ambigu. Plusieurs études épidémiologiques ont en effet montré une augmentation du risque aussi bien des carcinomes que des mélanomes chez les utilisateurs habituels de crème solaire [27]. Les études les plus récentes conduites avec des produits de couverture spectrale étendue des UVB aux UVA ne sont pas définitivement convaincantes. Certes un photoprotecteur externe UVA-UVB prévient la survenue de nouveaux naevus chez l’enfant [28] mais l’utilisation d’un photoprotecteur à large spectre ne prévient que la survenue des carcinomes spinocellulaires et non celle des carcinomes basocellulaires [29].

Une autre stratégie est de bloquer un mécanisme moléculaire déclenché dans la peau par l’exposition UV. Compte-tenu de ce qui a été dit ci-dessus sur le rôle des ERO dans les dommages occasionnés par les UV à la peau, l’apport exogène d’antioxydants est pertinente.

De nombreuses études [30] ont analysé la protection offerte contre les UV par l’alphatocophérol, la vitamine C ou le bétacarotène. Si des résultats intéressants ont été obtenus in vitro sur culture cellulaire et chez l’animal par application topique, l’utilisation de ces molécules en monothérapie chez l’homme s’est en revanche avérée décevante contre l’érythème solaire comme contre la photo-immunosuppression [30]. De la même manière, le bétacarotène n’a pas d’effet préventif sur la survenue des cancers cutanés [31]. Son apport nutritif supplémentaire paraît même négatif dans certaines études [29-32]. Ces résultats décevants pourraient être expliqués par la non prise en compte, lors d’une monothérapie, de la synergie d’action des antioxydants. Les études récentes d’association vitamine E et vitamine C [33] ou vitamine C et bétacarotène [34] montrent d’ailleurs une protection significative contre l’érythème solaire.

La protection antiradicalaire « diététique » par les acides gras polyinsaturés [35-38] ou les régimes riches en flavonoïdes [39-41] doit être mieux évaluée.

En l’état actuel, le champ reste donc libre pour évaluer de nouvelles voies de photoprotection contre les cancers cutanés.

Photoprotection par l’amélioration de la défense antioxydante endogène

Nous avons pris l’option de nous intéresser au système antioxydant endogène de la cellule. L’apport supplémentaire de molécules adéquates, en induisant certains de ces systèmes, peut laisser espérer une amélioration des performances de la défense antioxydante en la rendant apte à contrôler une production excessive des ERO.

Rôle du glutathion, du sélénium et du zinc dans la défense antioxydante

Nous nous sommes intéressés au glutathion et à deux oligo-éléments, le zinc et le sélénium, dont le rôle antioxydant est étroitement lié au métabolisme du glutathion.

Le glutathion

Il est le plus important thiol libre non protéique dans les cellules des mammifères. Sa synthèse nécessite 3 acides aminés (le l-glutamate, la glycine et la l-cystéine), les deux premiers étant généralement en quantité substantielle dans les cellules, le facteur limitant de cette synthèse est la cystéine.

Le glutathion est un piégeur d’ERO efficace, notamment contre le radical hydroxyle et l’oxygène singulet. C’est aussi le cofacteur enzymatique des glutathionperoxydases sélénodépendantes (GPX). Ces enzymes sont formées de 4 sous-unités contenant chacune un atome de sélénium sous forme de sélénocystéine, qui constitue le site actif de l’enzyme. Elles décomposent les hydroxyperoxydes organiques et le peroxyde d’hydrogène en eau en utilisant le glutathion comme principale source d’hydrogène.

Enfin, le glutathion peut régénérer d’autres antioxydants comme l’alpha-tocophérol et l’ascorbate [42].

L’apport de glutathion ou de son précurseur, la cystéine, n’est pas justifié car ces molécules ne pénètrent pas dans la cellule. Ce handicap peut être surmonté par l’utilisation de dérivés de la cystéine à bonne pénétration intracellulaire. Il a été ainsi montré que la N-acétyl-cystéine (NAC) pouvait augmenter la biosynthèse du glutathion en augmentant le taux de cystéine intracellulaire [43]. La NAC a par ailleurs une action antioxydante propre par épuration des radicaux libres et de l’oxygène singulet [44].

Le sélénium

Son rôle antioxydant passe par les GPX. Le sélénium est indispensable à la synthèse et à l’activité de ces enzymes. Ainsi chez la souris, un régime carencé en sélénium diminue le taux épidermique de GPX et favorise le développement de cancers cutanés induits par une irradiation ultraviolette [45]. Chez l’homme, un lien a été montré entre un taux plasmatique bas en sélénium et le développement de cancers cutanés [46] ; une valeur prédictive du status sérique en sélénium pour la survenue ultérieure d’un carcinome spinocellulaire a aussi été mise en évidence [47].

L’évaluation de l’effet photoprotecteur d’un apport en sélénium apparaît particulièrement pertinente.

Le zinc

Cet oligoélément est lié à un grand nombre de molécules biologiques influant sur leur conformation, leur stabilité et leur activité. Il a de multiples implications dans le métabolisme cellulaire.

Un nombre considérable de travaux ont étudié les effets du zinc sur la régulation du potentiel redox cellulaire et les mécanismes de ceux-ci [48-49]. Dans de nombreux systèmes, le zinc est décrit comme étant un antioxydant et ses propriétés antioxydantes peuvent être reliées à de multiples mécanismes d’action. Le plus couramment évoqué est une interférence avec le métabolisme d’autres métaux (fer ou cuivre) capables de catalyser des réactions d’oxydation ; par exemple le zinc protège les groupements thiols contre l’oxydation catalysée par le fer en se liant aux fonctions SH avec une affinité supérieure à celle du fer. Par ailleurs, grâce à son rôle structurant, le zinc stabiliserait la superoxyde dismutase à cuivre-zinc facilitant son action.

Enfin, ce rôle structurant maintiendrait la structure tridimensionnelle de nombreux facteurs de transcription, favorisant leur liaison à l’ADN.

Nos travaux expérimentaux

Par nos travaux expérimentaux, nous avons confirmé tout d’abord l’effet cytotoxique dose-dépendant des UVA1 [15-17].

L’irradiation UVA1 induit une forte peroxydation lipidique mise en évidence par une augmentation des TBARs dans le surnageant des cellules non supplémentées [17]. Cette induction de la peroxydation lipidique par les UVA a déjà été mise en
évidence dans de nombreuses études [50, 51], nous montrons ici qu’elle est le fait des UVA1.

Les apports supplémentaires au milieu de survie des cellules en zinc, en sélénium ou en composés thiols (NAC, CIT et OTC) protègent très significativement la cellule de l’effet cytotoxique des UVA1 [15-17].

Parmi les dérivés thiols étudiés deux d’entre eux (NAC et CIT) augmentent significativement le taux de glutathion réduit dans la cellule. Ces deux composés ont un effet synergique avec le sélénium et cette association procure une très haute protection contre la cytotoxicité des UVA1. Le troisième composé, l’OTC, a aussi un effet cytoprotecteur contre les UVA1 probablement par ses capacités antioxydantes propres car il n’induit pas de synthèse de glutathion ; il n’a en revanche pas d’effet synergique avec le sélénium. La déduction logique de ces différents résultats est que les dérivés qui augmentent le contenu intracellulaire en glutathion agissent par une induction de la GPX, enzyme sélénodépendante dont le cofacteur est le glutathion.

Cette hypothèse est confirmée par la constatation d’une élévation de la GPX induite par l’apport en sélénium parallèle à l’effet cytoprotecteur [17].

De plus, le sélénium et le zinc protègent les cellules supplémentées contre la peroxydation lipidique induite par les UVA1 attestant que l’effet cytoprotecteur contre les UVA1 de ces deux oligoéléments relève d’une amélioration de la détoxication des ERO produits lors de l’irradiation [17].

Le zinc protège aussi de la cytotoxicité induite par les UVB [16]. Ce résultat peut être lié à l’action antioxydante car il est admis qu’à côté de leur action directe sur certaines cibles cellulaires, les UVB induisent une forte production d’ERO [51, 52].

Il peut cependant être lié aux multiples autres actions biologiques du zinc.

Nous montrons d’autre part que les UVA1 causent des dégâts importants à l’ADN [19, 20]. Ces dégâts sont prévenus par l’apport de zinc, de sélénium ou des dérivés thiols aux cellules. Ces résultats, rapprochés des précédents, conduisent à penser que les effets négatifs des UVA1 sur l’ADN passent au moins en partie par la production d’ERO et qu’une stimulation de la défense antioxydante endogène est à même de prévenir les conséquences génomiques néfastes de l’exposition UVA1.

Par ailleurs le zinc protège aussi de la génotoxicité des UVB [18]. Il est admis que cette génotoxicité des UVB relève de manière prédominante d’un mécanisme d’action direct avec production des CPD et de 6-4 pp.

Dès lors, la protection génomique procurée par le zinc semble s’exercer vis-à-vis des différents types de dégâts, directs et indirects, induits à l’ADN par les UV et une telle protection contre les effets délétères des UV de l’ensemble du spectre solaire est particulièrement intéressante à considérer.

Quelques autres résultats de la littérature vont dans le sens des nôtres.

La protection génomique offerte par la NAC a déjà été soulignée : dans des fibroblastes et des kératinocytes en culture, la NAC supprime l’activation UV-induite de p53 et réduit l’expression des proto-oncogènes c-fos et c-jun [53].

D’autres études ont montré que la NAC prévient l’immunosuppression systémique quand elle est appliquée localement avant une irradiation UVB [54]. Cette action n’est ni liée à l’isomérisation de l’acide urocanique [55] ni à la production de CPD ou de 6-4 pp sur l’ADN par les UVB [56]. L’action de la NAC relèverait ainsi de capacités d’épurer les ERO impliquées dans l’immunosuppression UV-induite [57].

La NAC pourrait exercer son rôle protecteur à la phase de post-initiation de la photoimmunosuppression par le biais du facteur de transcription NF-κB dont elle peut inhiber l’activation [58]. NF-κB est en effet activé par les UVA [59] ; or l’activation de NF-κB a pour conséquences une augmentation de la transcription de nombreux gènes codant par des médiateurs impliqués dans la réponse immune (tel TNF-α, Il1, Il3, Il6, Il12) [60, 61].

Ces résultats sur la protection contre la photo-immunosuppression et les nôtres sur la protection génomique font apparaître la NAC et plus généralement les composés thiols, aptes à augmenter la concentration intracellulaire en glutathion, comme des candidats prometteurs à une protection contre les cancers cutanés photoinduits. Ils protègent en effet contre les deux mécanismes supposés prédominants dans la photocarcinogenèse, la photo-immunosuppression et les dommages à l’ADN géné- rateurs de mutations.

La protection génomique exercée par le sélénium a été mise en évidence d’une part par une inhibition quasi-complète des composés simples brins de l’ADN induits par un stress oxydant chimique (H O ) [62] et, d’autre part, par une inhibition de 2 2 l’accumulation de photo-produits de l’ADN dans des kératinocytes en culture irradiés par les UVB [63].

Quelques études animales sont aussi intéressantes. Le traitement systémique de la souris par le sélénium et la sélénocystamine augmente l’activité GPX et réduit la cancérogenèse chimiquement induite chez la souris [64]. Nous avons nous-même antérieurement montré que l’application topique d’une eau riche en sélénium était efficace pour prévenir la péroxydation lipidique et l’induction de carcinomes spinocellulaires par des irradiations répétitives chez la souris Hairless [65].

Enfin, chez l’homme, la supplémentation orale en sélénium réduit l’érythème et la formation de cellules apoptotiques après exposition UVB, du moins en combinaison avec les vitamines A et E [66]. Le seul essai de prévention de survenue d’un deuxième cancer cutané par la prise orale de sélénium s’est révélé un échec [67]. Ce résultat n’est pas étonnant car on peut penser que les dégâts cellulaires étaient déjà constitués au moment de l’induction de l’apport alimentaire supplémentaire. Le sélénium ne pouvant être incorporé dans le GPX qu’après la transcription, l’apport de sélénium doit survenir avant l’exposition UV pour laisser le délai nécessaire à l’activation de la synthèse de la GPX [68].

Très peu d’équipes se sont intéressées à l’effet photoprotecteur du zinc. Seule une étude [69] a montré sur la souris Hairless que l’application topique de chlorure de zinc à 1 % pouvait réduire le nombre de « sunburn cells » (témoin cellulaire de l’agression de l’ADN) par une irradiation UVB.

Au total, nous avons montré que :

— les UVA1 ont une part prépondérante dans la cytotoxicité des UVA et qu’ils exercent celle-ci par la génération d’ERO ;

— que trois acteurs majeurs de la défense antioxydante endogène, le zinc, le sélénium et la glutathion protégent de la cytotoxicité et des dommages à l’ADN induits par l’exposition des cellules aux UVA1 lorsqu’ils sont apportés de manière supplémentaire à la cellule ;

— que ces molécules peuvent, dans certaines circonstances, avoir une action synergique augmentant l’effet photoprotecteur.

Il est vrai que ces résultats in vitro ne peuvent être de facto transposés à la clinique humaine pour proposer une nouvelle stratégie de photoprotection.

Il faut rappeler que la plupart de nos études ont été faites sur fibroblastes humains normaux et non sur des kératinocytes ou des mélanocytes, cellules impliquées dans les cancers cutanés. Ce choix a été fait de par la facilité de cultiver ce type cellulaire et surtout la bonne adaptation de celui-ci à l’analyse des effets des UV. La culture de kératinocytes normaux ou de mélanocytes normaux est beaucoup plus délicate. Par ailleurs, la reproductibilité des résultats lors de l’irradiation de kératinocytes pose problème car les doses lumineuses nécessaires à l’induction des phénomènes biologiques analysés sont beaucoup plus élevées imposant, avec les appareillages d’irradiation utilisés, des temps d’irradiation longs interférant sur la viabilité des cellules dans les milieux de survie. Le choix de lignées tumorales nous a paru non cohérent avec l’objectif, à savoir une prévention de la survenue tumorale. La lignée kératinocytaire HaCat n’a pas les caractères d’une lignée tumorale mais diffère cependant des cellules normales, en particulier car elle est porteuse d’une protéine p53 mutée ;

elle est en revanche également bien adaptée aux études avec irradiation UV.

Nos travaux actuels visent à mieux comprendre l’effet génoprotecteur de zinc lors d’une irradiation UV. Nous nous intéressons pour cela tout particulièrement aux métallothionéines, petites protéines riches en groupement thiol dont le rôle physiologique principal est de réguler l’homéostasie intracellulaire du zinc et du cuivre.

Nos premiers résultats montrent que l’effet photoprotecteur du zinc pourrait être médié par l’induction des métalloprotéines.

Nous nous intéressons aussi à la thioredoxine, petite protéine ubiquitaire à fonctions multiples qui pourrait avoir un rôle aussi important que la glutathion dans la régulation redox de la cellule contre le stress oxydatif. Nous avons déjà montré que la thioredoxine est induite par les UVA et qu’elle a un effet protecteur contre la cytotoxicité des UVA. Nous analysons maintenant des capacités à maintenir l’inté- grité génomique des cellules après irradiation UVA.

BIBLIOGRAPHIE [1] ROBERT C., DUBERTRET L. — Cancers de la peau. Leurs liens avec les rayons ultraviolets.

Presse

Méd., 1995, 24, 1610-1616.

[2] BEANI J.C. — Actions biologiques du rayonnement solaire sur la peau.

Rev. Int. Pédiatrie, 1995, 259 bis, 2-7.

[3] DE GRUIJL F.R., STERENBORG C.M., FORBES P.D., DAVIES R.E., COLE C., KELFKENS G., VAN DER LEUN H., SLAPER H., VAN DER LEUN J.C. — Wavelenght dependence of skin cancer induction by ultraviolet irradiation of albinos hairless mice. Cancer Res., 1993, 53, 53-60.

[4] SETLOW R.B., GRIST E., THOMPSON K., WOODHEAD A.D. — Wavelenght effective in induction of malignant melanoma. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1993, 90 , 6666-6670.

[5] BLACK H.S. — Potential involvement of free radical reactions in ultraviolet light-mediated cutaneous damage. Photochem. Photobiol ., 1987, 46, 213-221.

[6] DARR B., FRIDOVICH I. — Free radicals in cutaneous biology.

J. Invest. Dermatol ., 1994, 102, 671-675.

[7] MOSSMAN T. — Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival : application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65, 55-63.

[8] SHOPSIS C., MACKAY G.J. — A semi-automated protein assay for cell cultures.

Anal Biochem ., 1984, 140, 104-107.

[9] RICHARD M.J., PORTAL B., MEO J., COUDRAY C., HADJIAN A., FAVIER A. — Malondialdehyde kit evaluated for determining plasma and lipoprotein fractions that react with thiobarbituric acid. Clin Chem ., 1992, 38, 704-709.

[10] PEAK M.J, PEAK J.G. — Hydroxyl radical quenching agents protect against DNA breakage caused by both 365-nm UVA and by gamma radiation. Photochem Photobiol ., 1990, 51, 649-652.

[11] BIRNBOIM H.E., JEVCAK J.J. — Fluorometric method for rapid detection of DNA strand breaks in human white blood cells produced by low doses of radiation . Cancer Res, 1981, 41, 1889-1892.

[12] FAIRBAIRN D.W., OLIVE P.L., O’NEILL K.L. — The comet assay : a comprehensive review.

Mutat. Res., 1995, 339, 37-59.

[13] OSTLING O., JOHANSON K.J. — Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 123, 291-298.

[14] SINGH N.P., MCCOY M.T., TICE R.R., SCHNEIDER E.L. — A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell. Res., 1988, 175, 184-191.

[15] EMONET N., LECCIA M.T., FAVIER A., BEANI J.C., RICHARD M.J. — Thiols and selenium :

protective effect on human skin fibroblasts exposed to UVA radiation. J. Photochem. Photobiol.

B. Biol., 1997, 40 , 84-90.

[16] RICHARD M.J., GUIRAUD P., LECCIA M.T., BEANI J.C., FAVIER A. — Effect of zinc supplementation on resistance on cultured human skin fibroblasts toward oxidant stress. Biol. Trace Elem.

Res., 1993, 37, 187-199.

[17] LECCIA M.T., RICHARD M.J., BEANI J.C., FAURE H., MONJO A.M., CADET J., AMBLARD P., FAVIER A. — Protective effect of Selenium and zinc on UV-A damage on human skin fibroblasts. Photochem. Photobiol., 1993, 58, 548-553.

[18] PARAT M.O., RICHARD M.J., POLLET S., HADJUR C., FAVIER A., BEANI J.C. — Zinc and DNA fragmentation in keratinocyte apoptosis : Its inhibitory effect in UVB irradiated cells. J.

Photochem. Photobiol. B. Biol., 1997, 31, 101-106.

[19] LECCIA M.T., RICHARD M.J., FAVIER A., BEANI J.C. — Zinc protects against ultraviolet A1-induced DNA damage and apoptosis in cultured human fibroblasts. Biol. Trace El. Res., 1999, 69, 177-190.

[20] EMONET-PICCARDI N., RICHARD M.J., RAVANAT J.L., SIGNORINI N., CADET J., BEANI J.C. — Protective effects of antioxidants against UVA-induced DNA damage in human skin fibroblasts in culture. Free Rad. Res., 1998, 29, 307-313.

[21] MONTEIRO H.P., STERN A. — Redox modulation of tyrosine phosphorylation-dependent signal transduction pathways. Free Radic Biol Med, 1996, 21, 323-333.

[22] SEN C.K., PACKER L. — Antioxidant and redox regulation of gene transcription.

FASEB J, 1996, 10 , 709-720.

[23] MUKHTAR H., ELMETS C.A. and 51 others coauthors — Photocarcinogenesis : mechanisms, models and human health implications. Invited Review. Photochem. Photobiol., 1996, 63, 355-447.

[24] MUKHTAR H., FORBES P.D., ANANTHASWAMY H.N — Photocarcinogenesis : models and mechanisms. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed ., 1999, 15 , 91-95.

[25] BERNEBURG M., KRUTMANN J. — Photoimmunology, DNA repair and photocarcinogenesis.

J.

Photochem. Photobiol. B. biol ., 2000, 54 , 87-93.

[26] KRUTMAN J., CZECH W., PARLOW F., TREFZER U., KAPP A., SCHOEPF E., LUGER T.A. — Ultraviolet radiation effects on human keratinocyte ICAM-1 expression : UV induced inhibition of cytokine induced ICAM-1 mRNA expression is transient, differentially restored of IFN-y versus TNF-a, and followed by ICAM-1 induction via TNF-a like pathway. J. Invest.

Dermatol., 1992, 98, 923-928.

[27] BEANI J.C. — Photoprotecteurs externes et cancers cutanés.

Ann. Dermatol. Vénéréol ., 1996, 10, 666-674.

[28] GALLAGHER R.P., RIVERS J.K., LEE T.K., BAJDIK C.D., MCLEAN D.I., COLDMAN A.J. — Broad-spectrum sunscreen use and the development of new nevi in white children : A randomized controlled trial. JAMA , 2000, 14, 283, 2955-2960.

[29] GREEN A., WILLIAMS G., NEALE R., HART V., LESLIE D., PARSONS P., MARKS G.C., GAFFNEY P., BATTISTUTTA D., FROST C., LANG C., RUSSELL A. — Daily sunscreen application and betacarotene supplementation in prevention of basal-cell and squamous-cell carcinomas of the skin :

a randomised controlled trial. Lancet , 1999, 28, 354, 723-729.

[30] FUCHS J. — Potentials and limitations of the natural antioxidants RRR-alpha-tocopherol, L-ascorbic acid and beta-carotene in cutaneous photoprotection. Free Radic. Biol. Med., 1998, 25, 848-873.

[31] FRIELING U.M., SCHAUMBERG D.A., KUPPER T.S., MUNTWYLER J., HENNEKENS C.H. — A randomized, 12-year primary-prevention trial of beta carotene supplementation for nonmelanoma skin cancer in the physician’s health study. Arch Dermatol ., 2000, 136, 179-184.

[32] GREENBERG E.R., BARON J.A., STUKEL T.A., STEVENS M.M., MANDEL J.S., SPENCER S.K., ELIAS P.M., LOWE N., NIERENBERG D.W., BAYRD G. et al. — A clinical trial of beta carotene to prevent basal-cell and squamous-cell cancers of the skin. The Skin Cancer Prevention Study Group. N. Engl. J. Med., 1990, 323, 789-795.

[33] EBERLIN-KONIG B., PLACZEK M., PRZYBILLA B. — Protective effect against sunburn of combined systemic ascorbic acid (vitamin C) and d-alpha-tocopherol (vitamin E). J. Am. Acad.

Dermatol ., 1998, 38, 45-48.

[34] BOEHM F., EDGE R., LAND E.J., MCGARVEY D.G., TRUSCOTT T.G. — Carotenoids enhance vitamin E antioxidant efficiency. J. Am. Chem. Soc., 1997, 119 , 621-622.

[35] RHODES L.E. — The role of omega-3 polyunsaturated fatty acids dermatology.

Cur. Med.

Literature , 1996, 1, 63-68.

[36] BAIN C., GREEN A., SISKIN V., ALEXANDER J., HARVEY P. — Diet and melanoma. An exploratory case-control study. Ann. Epidemiol., 1993, 3, 235-238.

[37] BLACK H.S., THRONBY J.I., WOLF J.E., GOLDBERG L.H., HERD J.A., ROSEN T., BRUCE S., TSCHEN J.A., SCOTT L.W., JAAX S. — Evidence that a low-fat diet reduces the occurrence of non-melanoma skin cancer. Int. J. Cancer, 1995, 62, 165-169.

[38] LEY R.D., REEVE V.R. — Chemoprevention of UV radiation-induced skin cancer.

Environmen- tal Health Perspectives, 1997, 105, 981-984.

[39] KATIYAR S.K., ELMETS C.A., AGARWAL R., MUKHTAR H. — Protection against ultraviolet-B radiation-induced local and systemic suppression of contact hypersensitivity and oedema responses in C3H/HeN mice by green tea polyphenols. Photochem. Photobiol ., 1995, 62, 855-861.

[40] STEERENBERG P.A., GARSSEN J., DORTANT P., HOLLMAN P.C., ALINK G.M., KEDDER M., BUENO-DE-MESQUITA H.B., VAN LOVEREN H. — Protection of UV-induced suppression of skin contact hypersensitivity : a common feature of flavonoids after oral administration ? Photochem. Photobiol., 1998, 67, 456-461.

[41] LIU Q., WANG Y., CRIST K.A., WANG Z.Y., LOU Y.R, HUANG M.T, CONNEY A.H, YOU M. — Effect of green tea on p53 mutation distribution in ultraviolet B radiation-induced mouse skin tumors. Carcinogenesis, 1998, 19, 1257-1262.

[42] STEENVOORDEN D.P., BEIJERSBERGEN VAN HENEGOUWEN G. — The use of endogenous antioxidants to improve photoprotection. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 1997, 41, 1-10.

[43] STEENVOORDEN D.P., HASSELBAINK D.M., BEIJERSBERGEN VAN HENEGOUWEN G.M. — Protection against UV-induced reactive intermediates in human cells and mouse skin by glutathione precursors : a comparison of N-acetylcysteine and glutathione ethylester. Photochem Photobiol ., 1998, 67, 651-656.

[44] ARUOMA O.I., HALLIWELL B., HOEY B.M., BUTLER J. — The antioxidant action of N-acetylcysteine : its reaction with hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide, and hypochlorous acid. Free Radic Biol Med. , 1989, 6, 593-759.

[45] PENCE B.C., DELVER E., DUNN D.M. — Effects of dietary selenium on UVB-induced skin carcinogenesis and epidermal antioxidant status. J. Invest. Dermatol. , 1994, 102 , 759-761.

[46] CLARK L.C., GRAHAM G.F., CROUNSE R.G., GRIMSON R., HULKA B., SHY C.M. — Plasma selenium and skin neoplasm’s : a case-control study. Nutr Cancer, 1984, 6, 13-21.

[47] COMBS G.F., Jr, CLARK L.C., TURNBULL B.W., GRAHAM G.F., SMITH C.L., SANDERS B., Jr, TAYLOR J.R., LESHER J.L., PARK H.K., GLOVER R., CHALDER D.K., CHOU J., KLEIN L., ALLISON J.R. Jr. — Low plasma selenium predicts the 24 month incidence of squamous cell carcinoma of the skin in a cancer prevention trial. FASEB J ., 1993 , 7, A278.

[48] BRAY T.M., BETTGER W.J. — The physiological role of zinc as an antioxidant.

Free Radic. Biol.

Med., 1990, 8, 281-291.

[49] FAVIER A.E. — Zinc-ligand interactions and oxygen free radical formation.

In « Handbook of metal-ligand interactions in biological fluids ». G. Berthon (ed.), M. Dekker Inc., New-York, 1995, pp. 876-887.

[50] MOYSAN A., MARQUIS I., GABORIAU F., SANTUS R., DUBERTRET L., MORLIERE P. — Ultraviolet A-induced lipid peroxidation and antioxidant defense systems in cultured human skin fibroblasts. J Invest Dermatol., 1993, 100, 692-698.

[51] MORLIERE P., MOYSAN A., TIRACHE I. — Action spectrum for UV-induced lipid peroxidation in cultured human skin fibroblasts. Free Radic Biol Med ., 1995, 19, 365-371.

[52] PUNNONEN K., PUNTALA A., JANSEN C.T., AHOTUPA M. — UVB irradiation induces lipid peroxidation and reduces antioxidant enzyme activities in human keratinocytes in vitro . Acta

Derm Venereol ., 1991, 71, 239-242.

[53] GARMYN M., DEGREEF H. — Suppression of UVB-induced c-fos and c-jun expression in human keratinocytes by N-acetylcysteine. J. Photochem. Photobiol., biol., 1997, 37, 125-30.

[54] VAN DEN BROEKE L.T., BEIJERSBERGEN VAN HENEGOUWEN G.M. — Topically applied N-acetylcysteine as a protector against UVB-induced systemic immunosuppression. J Photochem Photobiol B ., 1995, 27, 61-65.

[55] HEMELAAR P.J., BEIJERSBERGEN VAN HENEGOUWEN G.M. — The protective effect of N-acetylcysteine on UVB-induced immunosuppression by inhibition of the action of cisurocanic acid. Photochem Photobiol ., 1996, 63, 322-327.

[56] NIJMEIJER B.A., STEENVOORDEN D.P., BEIJERSBERGEN VAN HENEGOUWEN G.M., ROZA L., VINK A.A. — The mechanism of N-acetylcysteine photoprotection is not related to dipyrimidine photoproducts. J Photochem Photobiol B ., 1998, 44, 225-230.

[57] CACERES-DITTMAR G., ARIIZUMI K., XU S., TAPIA F.J., BERGSTRESSER P.R., TAKASHIMA A. — Hydrogen peroxide mediates UV-induced impairment of antigen presentation in a murine epidermal-derived dendritic cell line. Photochem Photobiol ., 1995, 62, 176-183.

[58] REDONDO P., SUBIRA M.L. — N-acetylcysteine inhibits production of tumor necrosis factor alpha and interleukin-1 beta. Arch Intern Med., 1996, 156, 1238-1241.

[59] VILE G.F., TANEW-ILITSCHEW A., TYRRELL R.M. — Activation of NF-kappa B in human skin fibroblasts by the oxidative stress generated by UVA radiation. Photochem Photobiol ., 1995, 62, 463-468.

[60] LENARDO M.J., BALTIMORE D. — NF-kappa B : a pleiotropic mediator of inducible and tissue-specific gene control. Cell. , 1989, 28, 58, 227-229.

[61] ULLMAN K.S., NORTHROP J.P., VERWEIJ C.L., CRABTREE G.R. — Transmission of signals from the T lymphocyte antigen receptor to the genes responsible for cell proliferation and immune function : the missing link. Annu Rev Immunol., 1990, 8, 421-452.

[62] LEIST M., RAAB B., MAURER S., ROSICK U., BRIGELIUS-FLOHE R. — Conventional cell culture media do not adequately supply cells with antioxidants and thus facilitate peroxide-induced genotoxicity. Free Radic. Biol. Med., 1996, 21, 297-306.

[63] RAFFERTY T.S., MCKENZIE R.C., HUNTER J.A., HOWIE A.F., ARTHUR J.R., NICOL F., BECKETT G.J. — Differential expression of selenoproteins by human skin cells and protection by selenium from UVB-radiation-induced cell death. Biochem. J., 1998, 332, 231-6.

[64] PERCHELLET J.P., ABNEY N.L., THOMAS R.M., GUISLAIN Y.L., PERCHELLET E.M. — Effects of combined treatments with selenium, glutathione, and vitamin E on glutathione peroxidase activity, ornithine decarboxylase induction, and complete and multistage carcinogenesis in mouse skin. Cancer Res., 1987, 47, 477-85.

[65] CADI R., BEANI J.C., BELANGER S., RICHARD M.J., RICHARD A., FAVIER A., AMBLARD P. — Effet protecteur de l’application percutanée d’eau thermale Roche Posay vis-à-vis de la peroxydation lipidique et de la carcinogenèse cutanée induites par les UVB (sur la souris HAIRLESS).

Nouv. Derm., 1991, 10, 266-272.

[66] LA RUCHE G., CESARINI J.P. — Protective effect of oral selenium plus copper associated with vitamin complex on sunburn cell formation in human skin. Photodermatol Photoimmunol Photomed., 1991, 8, 232-5.

[67] CLARK L.C., COMBS G.F., TURNBULL B.W. et al. — Effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with carcinoma of the skin : a randomized clinical trial. Nutritional Prevention of Cancer Study Group. JAMA, 1996, 276, 1957-1963.

[68] VESSEY D.A — The cutaneous antioxidant system.

Clin. Dermatol., 1993, 8, 81-103.

[69] RECORD I.R., JANNES M., DREOSTI I.E. — Protection by zinc against UVA— and UVB-induced cellular and genomic damage in vivo and in vitro . Biol. Trace Elem. Res., 1996, 53, 19-25.

DISCUSSION

M. René MORNEX

Le test des comètes est très élégant et je suppose qu’il existe une corrélation entre la taille du halo et l’importance de l’altération de l’ADN. Pourquoi la diffusion se fait-elle de manière asymétrique ? Quel paramètre utilisez-vous qui tienne compte de la densité et de la surface ?

Le principe du test des comètes est basé sur les propriétés de migration de l’ADN dans un champ électrique. L’ADN est chargé négativement et migre vers l’anode ; la vitesse de migration dépend du nombre de fragments d’ADN. Après le marquage fluorescent l’image est ainsi celle d’une boule pour un noyau contenant un ADN intact et celle d’une comète pour un noyau contenant de l’ADN endommagé, c’est-à-dire présentant de nombreuses cassures de brin. L’analyse de l’image de la comète, par un logiciel spécifique, permet de déterminer différents paramètres qualifiant l’intensité des dommages à l’ADN. Nous avons retenu le moment de la queue de la comète défini comme le produit du pourcentage d’ADN dans la queue de la comète (qualifié par l’intensité de la fluorescence) par la distance entre le milieu de la tête et le milieu de la queue de la comète.

Ce moment est d’autant plus grand, en unité arbitraire, que l’ADN a été endommagé.

M. Maurice TUBIANA

Même des doses relativement faibles d’UV provoquent l’activation de plusieurs dizaines de gènes. Parmi ces gènes plusieurs comme le p53 ont un effet protecteur. Avez-vous comparé avec des puces à ADN l’activation des gènes avec et sans anti-oxydants ? Il y a, dans une cellule, deux principaux mécanismes de protection : la réparation de l’ADN et l’apoptose.

Ne serait-il pas utile d’étudier l’effet mutagène sur ces cellules survivantes qui pourrait donner des effets fort différents du test des comètes ? Les UV contribuent pour moitié au moins à l’effet cancérigène, quel est l’effet des antioxydants sur les dommages provoqués par les UVB ?

Effectivement, l’exposition UV même peu importante entraîne une activation de gènes.

Nous travaillons actuellement à l’analyse de cette activation par biopuces et le projet est d’évaluer le contrôle de cette activation par les molécules antioxydantes d’intérêt. Les analyses des dégâts génomiques par le test des comètes ici présenté ont été faites immédiatement après l’irradiation ; nous nous intéressons maintenant à la cinétique de réparation après l’irradiation en présence et en absence d’antioxydants. Une telle approche permettra de juger de « l’état » des cellules en fin de réparation après un stress UV et de la contribution éventuelle des antioxydants à une meilleure réparation. Parallèlement, le rôle des espèces réactives de l’oxygène dans le déclenchement de phénomènes apoptotiques est connu et nous avons montré dans d’autres études que le zinc prévenait l’apoptose induite tant par les UVA que par les UVB. Il importe certainement pour apprécier l’apport en terme de protection contre la cancérogenèse de s’assurer de l’intégrité génomique des cellules qui ont ainsi « échappé » à l’apoptose. La quantité et la qualité de la réparation sont deux facteurs fondamentaux à étudier avant toute conclusion. Les UVB induisent des dommages directs à l’ADN sous forme de photoproduits comme les dimères de pyrimidines. Ces dommages ont été longtemps considérés comme le mécanisme d’action des UVB dans la cancérogenèse. On sait aujourd’hui que les UVB
sont à l’origine d’un fort stress oxydant et les antioxydants doivent prévenir au moins une partie des dommages cellulaires UV-induits. Nous avons ainsi montré que le zinc et le sélénium, ainsi que d’autres antioxydants, protégeaient de la cytotoxicité des UVB et que le zinc protégeait des dégâts génomiques induits par les UVB.

M. Jean CIVATTE

Pensez-vous pouvoir mettre en évidence un effet anti-prolifératif en plus d’un effet photoprotecteur ? Comptez-vous tirer de vos travaux des conclusions pratiques et faire des essais chez l’homme par des applications locales, notamment sur des lésions cutanées actiniques précarcinomateuses dont on connaît l’évolution très lente ?

De nombreux travaux montrent que l’activation de facteurs de transcription, comme NF-B (nuclear factor-B), AP (activator protein 1), la protéine oncosuppressive p53, 1 intervenant dans la prolifération est modulée par les variations du potentiel redox intracellulaire. Les antioxydants pourraient par là-même moduler une activation de ces facteurs consécutive à un stress oxydant. La stratégie d’utilisation chez l’homme reste à définir. Cependant, il paraît probable que l’apport supplémentaire sera plus efficace s’il est fait avant la constitution des dommages cellulaires. Ainsi, l’effet synergique du sélénium et des dérivés thiols semble passer par l’activation de la glutathion peroxydase (GPX). Cette enzyme transforme le peroxyde d’hydrogène en eau et empêche l’action délétère de certaines espèces réactives d’hydrogène sur des molécules biologiques clés.

L’apport de sélénium, qui active la synthèse de la GPX, doit donc intervenir en prévention des dommages et non pas quand ils sont constitués. Ceci explique que l’essai de prévention d’un deuxième cancer cutané chez l’homme par l’apport supplémentaire de sélénium s’est avéré un échec.

M. Jacques BAZEX

La prescription des rétinoïdes pourrait-elle renforcer l’efficacité de ces molécules antioxydantes ?

Les rétinoïdes sont apparus efficaces à condition de les donner à doses suffisantes pour prévenir la survenue de nouveaux carcinomes surtout dans des populations à risque spécifique, comme les xeroderma pigmentosum ou les patients ayant subi une greffe d’organe. L’effet relève probablement des propriétés des rétinoïdes sur la différenciation cellulaire.

Bull. Acad. Natle Méd., 2001, 185, no 8, 1507-1527, séance du 27 novembre 2001