L’ischémie critique des membres inférieurs (ICMI), qui est la forme la plus sévère de l’AOMI, se manifeste par des douleurs au repos résistantes aux antalgiques évoluant depuis plus de quinze jours ou par des troubles trophiques. La viabilité du membre est toujours menacée et le pronostic général des patients est également compromis avec une mortalité autour de 50 % à cinq ans [1, 2]. La Transatlantic Intersociety Consensus (TASC), qui a récemment défini l’ICMI, souligne que « la notion de ICMI implique la notion de chronicité et doit être distinguée de l’ischémie aigüe des membres » [3, 4]. L’évaluation hémodynamique par la mesure de l’index de pression systolique (IPS) est fondamentale pour quantifier de façon objective la perfusion des membres inférieurs. Il est recommandé d’utiliser la mesure de la pression absolue à la cheville qui, pour définir une ICMI, doit être < 70 mm Hg et/ou une pression du gros orteil < 30 mm Hg et/ou une TcPo2 comprise entre 30 et 50 mm Hg. Dans ces conditions, le sauvetage chirurgical ou par angioplastie du membre s’impose mais il n’est pas toujours réalisable, faute d’axe receveur ou au décours d’interventions chirurgicales multiples. L’ICMI est souvent associée à des occlusions diffuses du lit artériel avec absence de vascularisation distale. Dans cette dernière situation, qui représente 20-30 % des cas, le traitement médical reste la seule ressource thérapeutique avant l’amputation [5]. Le consensus de la TASC estime que 10-30 % des patients avec ICMI seront décédés dans les six mois et 25-35 % devront subir une amputation majeure [6]. La mortalité peri-opératoire d’une amputation est de 5 à 10 % pour les amputations de jambe et 15 à 20 % pour les amputations au-dessus du genou. Cette situation, assez fréquente est un échec thérapeutique car aucun autre traitement n’a fait preuve de son efficacité.

La prostacycline et ses dérivés ont été utilisés initialement par perfusion intra artérielle puis intraveineuse dans plusieurs essais thérapeutiques. L’étude randomisée, la plus importante avec un dérivé de la prostacycline, l’étude ICAI, a conduit à proposer un traitement par perfusion de dérivés de la prostacycline chez les patients avec ICMI et un membre viable chez lesquels une revascularisation est impossible, particulièrement quand l’alternative est une amputation [6]. Malheureusement, si une efficacité transitoire apparaît à un mois elle ne persiste plus après six mois.

En prenant en compte les données précédentes sur le traitement médical de l’ICMI sans possibilité de revascularisation, on peut raisonnablement statuer qu’aucune des possibilités thérapeutiques actuelles ne permet d’améliorer nos patients et d’assurer le sauvetage de leur jambe en ischémie critique, lorsque les possibilités de revascularisation ne sont pas possibles [7].

THÉRAPIE

CELLULAIRE

DANS

L’ISCHÉMIE

CRITIQUE

LIÉE

A

L’ATHÉROSCLÉROSE

La découverte en 1997 par Ashara des précurseurs circulants des cellules endothé- liales chez l’homme adulte a révolutionné le concept d’angiogenèse post-natale [8].

De nombreux travaux ont confirmé l’existence de ces précurseurs, leur origine médullaire et leur aptitude à s’intégrer dans des structures vasculaires dans deux types de modèles : l’angiogenèse tumorale et la revascularisation d’un tissu isché- mique. Les cellules souches endothéliales adultes sont une source potentielle pour la régénération de l’endothélium dans le système cardiovasculaire et seraient un produit idéal de thérapie cellulaire autologue. On parle dans ce cas de vasculogénèse.

Des nombreux essais sur des models pré-cliniques d’ischémie ont utilisé la thérapie cellulaire pour induire une angiogénèse thérapeutique par intégration à un nouveau réseau vasculaire et/ou par sécrétion de facteur de croissance [9]. La thérapie cellulaire présente plusieurs avantages par rapport à la thérapie génique décrite précédemment. Tout d’abord elle a recours à l’utilisation de cellules autologues, prévenant ainsi tout risque de rejet. Elle prévient également le risque théorique de pathologies induites par la thérapie génique, liées soit directement à l’action du facteur de croissance codé par le plasmide injecté, soit à une insertion du plasmide, malgré toutes les précautions prises. Les cellules utilisées ont une origine médullaire et correspondent à des « cellules souches » dont les conditions de différentiation sont encore mal connues. Deux types de cellules ont été utilisées dans des essais pré-cliniques : les cellules endothéliales circulantes (PECs) dites précoces, ou encore appelées CFU-Hill, d’origine monocytaire (CD 14+) et les PECs dites tardives ou « outgrowth endothelial cells » (CD 14-) [revue dans 10]. Si ces cellules peuvent induire une angiogénese in vivo sur des modèles animaux, seules les cellules mononuclées de la moelle osseuse (BMMNCs), ou les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMNCs) après stimulation par le G-CSF, ont été utilisées chez l’homme dans des essais cliniques de phase I et II. Après des travaux encourageants chez l’animal, la première étude a été réalisée chez l’homme en 2002 par injection intramusculaire de cellules mononuclées médullaires autologues chez des patients en ischémie critique chronique des membres inférieurs [11] . Un premier groupe de vingt-cinq patients avec ischémie unilatérale avait reçu des cellules médullaires dans le membre malade et du sérum physiologique dans le membre inférieur controla- téral. Un second groupe de vingt-deux patients avec ischémie bilatérale a été randomisé entre cellules médullaires et cellules mononuclées d’origines sanguine, ces dernières servant de témoin. A vingt-quatre semaines, une amélioration significative a été notée chez les patients traités par cellules médullaires, sur tous les paramètres cliniques et une néo-angiogenèse a été objectivée sur les artériographies des membres inferieurs. La tolérance a été parfaite. Huang et al ont publié une approche similaire qui repose sur l’utilisation des cellules mononucléées périphériques (PBMNCs) après leur mobilisation par l’injection sous-cutanée 600 μg/jour de G-CSF pendant cinq jours. Au cinquième jour de stimulation environ 300 ml de PBMNCs ont été recueillies et concentrées, puis injectées dans la jambe ischémique dans 40 sites pour un total de 3×10 9 PBMNCs. Les auteurs ont randomisé vingt-huit patients avec un diabète et ICMI pour recevoir de PBMNCs ou traitement conventionnel avec suivi à trois mois [12]. Les principaux symptômes (douleurs et ulcères) ont été significativement améliorés chez les quatorze patients traités. Aucune amputation n’a du être effectué dans le groupe traité contre cinq chez les témoins (P=0,007). Cet étude suggère que la transplantation autologue de PBMNCs, après stimulation par le G-CSF, pourrait aussi être une procédure sure et efficace de l’ICMI. Elle a l’avantage de ne pas nécessiter d’anesthésie générale ni ponction de moelle osseuse. Récemment, les mêmes auteurs ont comparé ces deux types de cellules mononucléées en randoimisant cent cinquante patients qui ont reçu soit des cellules mononucléées médullaires, soit des cellules mononucléées isolées du sang périphérique après mobiulisation par du G-CSF [13]. Aucune différence significative dans la tolérance et l’efficacité n’a été mise en évidence. Il est important de bien analyser les procédures d’isolement des cellules utilisées comme produit de thérapie cellulaire car selon les procédures une grande variabilité existe avec des efficacités très certainement différentes [14].

Depuis 2002, une quarantaine de publications de thérapie cellulaire, principalement par cellules mononucléées médullaires ou périphériphériques (après mobilisation), ont été rapportées dans l’ischémie critique [15-17]. Ces études sont résumées dans le tableau I. A l’heure actuelle, plus de sept-cents cas de thérapie cellulaire ont été effectués chez l’homme, plus de la moitié dans des publications provenant d’Asie. En France, trois essais ouverts ont eu lieu dans cette indication à partir de cellules autologues mononuclées médullaires ou périphériques (Amiens, Nantes, Reims, Grenoble, Paris-HEGP et Marseille). Un essai national randomisé en double aveugle (étude BALI) a débuté en 2009 afin de démontrer si cette approche thérapeutique est réellement efficace sur les événements cliniques majeurs : amputations et mortalité.

Dans une étude anatomo-pathologique à partir des patients traités par thérapie cellulaire dans notre centre, nous avons récemment démontré in vivo chez l’homme le développement d’une néo-vascularisation importante par cette approche thérapeutique. L’analyse immuno-histochimique des échantillons d’amputation des patients ayant reçu une thérapie cellulaire est comparée avec celle des témoins, amputés pendant la même période et appariés par âge et sexe. Chez trois patients on a observé une angiogénèse active au niveau de la partie distale de la jambe isché- mique mais pas dans le muscle de la jambe. Touts les nouveaux vaisseaux sont positifs aux marqueurs endothéliaux (CD31, CD34, facteur de von Willebrand) et négatifs aux marqueures lymphatiques (podoplanin). Les marquages immunohistochimiques pour Ki 67 et c-kit on montré une prolifération endothéliale élevée dans les vaisseaux néo-formés [18]. Ces résultats sont intéressants car d’une part ils confirment ce qui a été observé dans les modèles pré-cliniques : la possibilité d’entraîner une néo-angiogenèse par cette approche thérapeutique. D’autre part, il n’est pas évident que les structures vasculaires formées, qui ressemblent aux lacs vasculaires observés au cours des malformations vasculaires, puissent permettre une revascularisation efficace en cas d’ischémie critique.

Une autre approche plus récente et tout aussi intéressante que la thérapie cellulaire par injection directe des cellules, concerne la réalisation de vaisseaux artificiels.

Cette autre approche innovante représente également une voix de développement pour les patients opérables mais n’ayant plus de matériel autologue pour réaliser ce geste [19].

THÉRAPIE CELLULAIRE DANS LA MALADIE DE BUERGER

La thérapie cellulaire ainsi que la thérapie génique ont aussi été utilisées chez les sujets ayant une maladie de Buerger. Cette dernière est une inflammation occlusive et segmentaire des artères et des veines, caractérisée par une thrombose des artères de petit et moyen calibre. Chez les patients avec une maladie de Buerger il est difficile d’obtenir une revascularisation chirurgicale car l’atteinte est toujours très distale.

Donc, en dehors de l’arrêt du tabac, les thérapies dont nous disposons à ce jour sont peu efficaces et ne garantissent pas une réponse prolongée ou une guérison complète.

Isner dès 1998 a conduit une étude clinique de phase I pour démontrer l’efficacité et la tolérance de l’injection intramusculaire de VEGF165 chez six patients avec une maladie de Buerger. Les résultats ont montré que, si la thérapie est mise en place avant le développement d’une gangrène, alors les patients peuvent obtenir une cicatrisation complète des ulcères et éviter l’amputation. Cependant cette étude ne comportait pas de groupe témoin [20]. La thérapie cellulaire a été réalisée dans une autre étude pilote qui a inclus huit patients avec maladie de Buerger [21]. Le traitement a eu recours à des cellules mononucléées prélevées à partir de la moelle osseuse avec un suivi de quatre ans : les résultats ont montré une amélioration prolongée des symptômes d’ischémie . Cependant l’intérêt principal de cet essai est d’avoir mis en évidence la possibilité d’effets secondaires dans cette population particulière de malades. En effet, un patient est décédé vingt mois après l’administration de la thérapie ; ce patient n’avait pas de facteurs de risque cardio-vasculaires, avec arrêt du tabac avant d’être inclus dans l’essai. On ne peut donc exclure que ce décès soit lié à la thérapie cellulaire pratiquée, la mortalité coronaire étant rare dans la maladie de Burger des sujets jeunes. Ainsi, l’injection de BMMNCs chez des souris invalidées pour le gêne de l’apolipoproteine E peut faciliter le développement des lésions d’athérosclérose, l’angiogenèse étant nécessaire au développement de la plaque intimale [22] ; d’où l’importance et la nécessité de réaliser des études permettant d’évaluer l’innocuité du traitement chez ces patients jeunes dont seul le pronostic fonctionnel est menacé.

Une étude indienne plus récente, a traité trente-six patients ayant une maladie de Buerger, sans décrire d’effets secondaire après un suivi de six mois [23].

CONCLUSION

À ce jour, aucune des études sur la thérapie cellulaire publiées ne permet de répondre de façon définitive sur l’efficacité et la tolérance de cette thérapeutique innovante. La réponse à cette question nécessitera la réalisation d’études de plus grandes tailles, randomisées et prenant comme événement primaire la diminution de fréquence des amputations majeures.

Si ces approches concernant des nouvelles perspectives thérapeutiques de l’artériopathie des membres inferieurs ouvrent des perspectives passionnantes elles soulè- vent aussi de nombreuses questions.

Quelles cellules doit on utiliser ? Plusieurs équipes s’intéressent aux cellules mésenchymateuses, adipocytaires, cellules souches embryonnaires et plus récemment les iPS. L’utilisation des cellules progénitrices endothéliales endogènes est également une approche intéressante mais qui se heurte à la rareté de ces cellules chez ces patients souvent âgés avec de nombreux facteurs de risque cardiovasculaires. De plus, on pense qu’un effet important de la thérapie cellulaire pourrait passer par un effet trophique avec la concentration locale de nombreux facteurs de croissance, lorsque les cellules injectées dans la zone ischémique meurent. Ces facteurs de croissance joueraient alors un rôle important en stimulant à leur tour des cellules souches vasculaires médullaires ou résidant dans une niche vasculaire afin de développer une vasculogenèse locale. D’où l’idée en cours d’étude de ne pas forcé- ment utiliser des cellules autologues, mais des cellules allogéniques. En effet, il existe peu de preuves dans les modèles animaux d’une réelle incorporation des cellules injectées dans les vaisseaux néo-formés, et en tout état de cause aucune preuve de ce type chez l’homme.

L’innocuité est-elle vraiment garantie sur le court terme mais aussi sur le long terme avec le risque théorique de stimuler le développement de cancers latents ou d’aggraver l’athérosclérose ? Ce point est particulièrement important dans l’utilisation de ces traitements dans la maladie de Buerger.

Par ailleurs, l’ischémie critique avec troubles trophiques, étant le stade ultime de l’artériopathie des membres inferieurs, est grevée d’une morbi- mortalité élevée. On peut se demander s’il s’agit du meilleur moyen de valider ces thérapies visant à stimuler l’angiogénèse dans l’artériopathie des membres inférieurs. Peut-être serait-il plus pertinent de s’intéresser aux patients ayant seulement des douleurs de repos ou de combiner la thérapie génique ou cellulaire à la réalisation de pontages distaux ou d’angioplasties chez des sujets ayant un meilleur pronostic.

BIBLIOGRAPHIE [1] Sobel M., Verhaeghe R. — Antithrombotic therapy for peripheral artery occlusive disease.

Ammerican College of Chest Physicians Evidence-based Clinical Practice Guidelines (8th Edition). Chest, 2008, 133 , 815S-843S.

[2] Norgren L., Hiatt W.R., Dormandy J.A., Nehler M.R., Harris K.A., Fowkes F.G. — TASC II Working Group.Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). J. Vasc. Surg., 2007, 45 , Suppl S., S5-67.

[3] Dormandy J.A., Rutherford R.B. — Management of peripheral arterial disease (PAD).

TASC Working Group. TransAtlantic Inter-Society Concensus (TASC). J. Vasc. Surg,, 2000, 31 ,

S1-S296.

[4] Second European Consensus Document on chronic critical leg ischemia — Circulation, 1991, 84 , IV, 1-26.

[5] Dorros G., Jaff M.R., Dorros A.M., Mathiak L.M., He T. — Tibioperoneal (outflow lesion) angioplasty can be used as primary treatment in 235 patients with critical limb ischemia:

five-year follow-up. Circulation, 2001, 104 , 2057-62.

[6] Prostanoid for chronic critical leg ischemia — A randomized, controlled, open label trial with prostaglandine E1. The ICAI study group.Ischemia Cronica degli arti inferiori Ann. Intern.

Med., 1999, 130 , 412-416.

[7] Schainfeld R.M., Isner J.M. — Critical limb ischemia: nothing to give at the office ?

[8] Ann. Intern. Med., 1999, 130 , 442-4.

[9] Asahara T., Murohara T., Sullivan A., Silver M., Van Der Zee R. Li T., Witzenbichler B., Schatteman G., Isner J.M. — Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science, 1997, 2275, 1964-7.

[10] Gulati R., Jevremovic D., Peterson T.E., Chatterjee S., Shah V., Vile R.G. et al . — Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood.

Circ.

Res., 2003, 93, 10023-5.

[11] Smadja D.M., Cornet A., Emmerich J., Aiach M., Gaussem P. — Endothelial progenitor cells: characterisation, in vitro expansion and prospect for autologus cell therapy.

[12]

Cell Biol. Toxicol., 2007, 8 , 351-8.

[13] Tateishi-Yuyama E., Matsubara H., Murohara T., Ikeda U., Shintani S., Masaki I. et al.

— Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet, 2002, 360 , 427-35.

[14] Huang P., Li S., Han M., Xiao Z., Han Z.C. — Autologus transplantation of granulocyte colony-stimulating factor-mobilized peripheral blood mononuclear cells improves critical limb ischemia in diabetes. Diabetes Care, 2005, 28 , 2155-60.

[15] Huang P.P., Yang X.F., Li S.W., Wen J.C., Zhang Y., Han Z.C. — Randomised comparison of G-CSF mobilized peripheral blood mononuclear cells versus bone marrow-mononuclear cells for the treatment of patients with lower limb arteriosclerosis obliterans. Thromb. Haemost. , 2007, 98 , 1335-42.

[16] Capiod J.C., Tournois C., Vitry F., Sevestre M.A., Daliphard S., Reix T., Nguyen P., Lefrere J.J., Pignon B. — Characterization and comparison of bone marrow and peripheral blood mononuclear cells used for cellular therapy in critical leg ischemia: towards a new cell therapy product. Vox. Sanguinis , 2008, in press.

[17] Pasqualoni E., Messas E., Fiessinger J.N., Emmerich J. — Perspectives thérapeutiques dans l’artériopathie des membres inférieurs : thérapie génique et cellulaire. Presse Med. , 2008, 37, 1039-46.

[18] Aranguren X.L., Verfaillie C.M., Luttun A. — Emerging hurdles in stem cell therapy for peripheral vascular disease. J. Mol. Med. , 2009, 87 , 3-16.

[19] Kalka C., Baumgartner I. — Gene and stem cell therapy in peripheral arterial occlusive disease. Vascular Medicine , 2008, 13 , 157-72.

[20] Duong J.P., Smadja D., Gaussem P., Emmerich J . et al. — Bone marrow derived mononuclear cell therapy induces distal angiogenesis after local injection in critical leg ischemia.

Modern Pathology, 2008, 21 , 837-46.

[21] L’Heureux N., McCallister T.N. — Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. . N. Engl. J. Med., 2007, 357 , 14.

[22] Isner J.M., Baumgartner I., Rauh G., Schainfeld R., Blair R., Manor O. et al. —

Treatment of thromboangioitiis obliterans (Buerger’s disease) by intramuscular gene transfer of vascular endothelial growth factor: preliminary clinical results. J. Vasc. Surg., 1998, 6 , 964-73.

[23] Miyamoto K., Nishigami K., Nagaya N., Akutsu K., Chiku M., Kamei M . et al . —

Unblinded Pilot study of Autologus Transplanation of Bone Marrow Mononuclear Cells in patients with Tromboangiitis Obliterans Circulation, 2006, 114 , 2679-2684.

[24] Silvestre J.S., Gojova A., Brun V., Potteaux S., Esposito B., Duriez M. et al. — Transplantation of bone marrow-derived mononuclear cells in ischemic apoliprotein-E knock- out mice accelerates atherosclerosis without altering plaque composition. Circulation, 2003, 108 , 2839- 2842.

[25] Motukuru V., Suresh K.R., Vivekanand V., Raj S., Girija K.R. — Therapeutic angiogenesis in Buerger’s disease (thromboengiitis obliterans) patients with critical limb ischemia by autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells. J. Vasc. Surg., 2008, 48 , 52S60S.

DISCUSSION

M. Claude JAFFIOL

Pouvez-vous préciser si les résultats de la thérapie cellulaire sur la vascularisation périphé- rique sont influencés par l’insuline ou les statines ? Quel est l’avenir de cette thérapeutique, compte tenu de la persistance des facteurs de risque pour de nombreux diabètiques ?

Les facteurs de risque cardiovasculaire, y compris le diabète, diminuent les progéniteurs endothéliaux circulants chez l’homme. Inversement les statines, augmentent les progéniteurs endothéliaux circulants. Ceci dit, la grande majorité des patients ayant une ischémie critique ont des facteurs de risque cardiovasculaires et reçoivent maintenant des statines, et ce sont vers eux que se dirigent ces approches thérapeutiques en cours d’évaluation.

Mme Monique ADOLPHE

Pensez-vous qu’en thérapie cellulaire il n’est pas plus judicieux d’utiliser plusieurs types cellulaires puisqu’un organe lésé est rarement constitué d’un seul type ?

Dans des modèles animaux, l’utilisation de différents types cellulaires, comme les progé- niteurs endothéliaux « tardifs » et « précoces » (d’origine monocytaire) s’est avéré être synergique. Chez l’homme, l’utilisation des cellules autologues mononucléées de la moëlle est de facto une utilisation de différents types cellulaires.

M. Yves CHAPUIS

Peut-on faire un rapprochement entre la stimulation de l’angiogénèse dans les membres ischémiques par injection de cellules souches, qu’elles soient intra-musculaires ou intravasculaires et l’effet angiogénétique obtenu par artérialisation distale du réseau veineux, source de modifications hémodynamiques et d’un apport d’oxygène, tel que l’a montré notamment Francisco Lengua, chirurgien à Lima ? Un des travaux cités semble montrer un effet meilleur dans les cas où l’injection se fait par plusieurs injections intra-musculaires plutôt que par voie vasculaire directe. Indépendamment d’un accès stimulant plus direct, n’y a-t-il pas un effet mécanique, traumatique, de l’injection par aiguilles ?

Votre question souligne l’impérieuse nécessité d’effectuer des études randomisées afin de démontrer l’efficacité de ces approches. Ceci est le cas dans l’étude multicentrique française BALI, en cours de réalisation, et coordonnée par Bernard Pignon. Quant à l’astucieuse idée de réaliser des pontages veineux distaux chez les patients en ischémie critique, cette approche est abandonnée à l’heure actuelle, car elle n’a pas démontré son efficacité et elle est source d’œdème du membre ponté.

Bull. Acad. Natle Méd., 2009, 193, no 3, 549-558, séance du 3 mars 2009