INTRODUCTION

Les phagocytes « professionnels » disposent d’un arsenal moléculaire microbicide, constitué notamment par une NADPH oxydase qui catalyse la production d’anions superoxyde O —. Tout défaut de fonctionnement ou d’activation de la NADPH 2 oxydase entraîne une incapacité des phagocytes à tuer et à digérer les microorganismes internalisés par endocytose, ce qui est observé dans la granulomatose septique chronique [1, 2].

A la fin des années 50, les premières observations ont conduit à individualiser cette maladie granulomateuse de l’enfant [3]. Sbarra et Karnovsky ont ouvert une voie de recherche ciblée sur la NADPH oxydase des phagocytes et les espèces réactives de l’oxygène, les ROS [4]. Ce fut le point de départ d’une aventure passionnante ; dès 1978, Segal associe un cytochrome de type b à l’activité oxydase catalysée [5]. Le cytochrome b des phagocytes servira de fil conducteur à tous les travaux réalisés 558 par la suite. Il est le « cœur » fonctionnel de la NADPH oxydase et au centre des recherches sur les radicaux oxydants dans le vieillissement cellulaire et tissulaire. On sait maintenant que la NADPH oxydase révélée à l’origine dans les phagocytes est ubiquitaire [6, 7]. Ainsi une nouvelle famille de NADPH oxydases, les Nox a été identifiée dans des cellules non phagocytaires avec l’existence d’isoformes du cytochrome b . Dans la classification établie, gp91-phox, le composant redox de la 558 NADPH oxydase phagocytaire est Nox 2.

Nous avons débuté à Grenoble les recherches sur la NADPH oxydase et le cytochrome b des phagocytes dès 1980 avec un premier cas de granulomatose septique 558 chronique. Nous nous sommes intéressés tout d’abord au fonctionnement de cette voie métabolique qui est directement liée à la respiration cellulaire des neutrophiles stimulés [8], puis nous avons focalisé nos travaux de recherche sur le cytochrome b558 [9]. Les connaissances ont alors progressé ; la compréhension d’un mécanisme fonctionnel complexe a bénéficié des différents cas de granulomatose septique auxquels nous avons été confrontés.

Dans la plupart des travaux, nous avons utilisé deux modèles cellulaires, les polynucléaires neutrophiles humains d’une part et d’autre part les lymphocytes B grâce auxquels les mutations identifiées dans les neutrophiles des patients atteints de granulomatose septique ont été immortalisées par le virus d’ Epstein-Barr [10].

FIG. 1. — Activation de la NADPH oxydase dans les neutrophiles stimulés.

Le contact d’un neutrophile (PMN) avec une bactérie pathogène qu’il reconnaît déclenche une respiration cellulaire foudroyante mais transitoire. L’oxygène consommé est réduit en ion — superoxyde O , chef de file d’espèces dérivées de l’oxygène oxydantes et toxiques, les ROS. Au 2 cours de la phagocytose des bactéries, les différentes populations de granules des neutrophiles déversent leur contenu dans la vésicule de phagocytose.

Je décrirai dans une première partie les modalités de fonctionnement de la NADPH oxydase pour aborder ensuite l’analyse des bases moléculaires de son dysfonctionnement dans la granulomatose septique et enfin des approches nouvelles en terme de régulation qui devraient ouvrir des perspectives d’avenir en thérapeutique.

La NADPH oxydase phagocytaire

La NADPH oxydase des phagocytes (Phox) a été identifiée pour la première fois dans les polynucléaires neutrophiles [1]. Sur un site infectieux, le contact entre une bactérie opsonisée et ces cellules déclenche une consommation d’oxygène grâce à l’activité d’un système enzymatique qui possède la caractéristique d’être totalement inactif dans les neutrophiles de la circulation c’est à dire dans les cellules au repos.

La respiration cellulaire engendrée « respiratory burst » est foudroyante mais transitoire ; elle redevient normale en quelques minutes (Figure 1).

La spécificité de la réponse est liée à la présence de récepteurs de surface qui reconnaissent des médiateurs inflammatoires et (ou) infectieux (opsonines ou facteurs chimiotactiques) ; le signal transmis a comme objectif l’activation d’un système enzymatique destiné à consommer l’oxygène du milieu qui sera réduit en ion — superoxyde O , le donneur d’électron étant NADPH. Le transfert d’électrons est 2 orienté depuis NADPH dans le cytosol jusqu’à l’oxygène dans la vésicule de phagocytose ou dans le milieu extracellulaire. On trouve dans les lymphocytes B immortalisés par le virus d’ Epstein Barr , une oxydase proche de celle des neutrophiles mais l’activité de cette oxydase est particulièrement faible (≈ 100 fois inférieure à
celle des neutrophiles) [10]. Comme dans les neutrophiles, l’oxydase des lymphocytes B immortalisés est inactive dans la granulomatose septique [11]. L’anion supe— roxyde O , est le chef de file de toute une famille de dérivés oxydants et toxiques, les 2 — ROS. Ces espèces réactives de l’oxygène, anion superoxyde O , peroxyde d’hydro2 gène H O , radical hydroxyle OH• et oxygène singulet 1O ou celles qui en dérivent, 2 2 2 — hypochlorite HOCl, chloramine ou encore peroxynitrite ONOO sont décrites comme des éléments toxiques et mutagènes. Babior en effet démontre en 1984 le potentiel toxique de ces dérivés dans la bactéricidie médiée par les phagocytes stimulés [12].

La NADPH oxydase est un complexe protéique de transfert d’électrons dont l’activité dépend de l’assemblage au niveau membranaire d’un composant redox, le cytochrome b et de facteurs protéiques solubles, dont le nom (sigle) dérive de leur 558 poids moléculaire et la terminologie « phox » de « ph agocyte o xydase » ; il s’agit de p47-phox, p67-phox, p40-phox et d’une protéine G monomérique, Rac 1/2, l’ensemble de ces facteurs étant présent dans le cytoplasme des cellules non stimulées. Le cytochrome b est le cœur redox de la NADPH oxydase des phagocytes. Il est 558 formé de deux sous-unités, gp91-phox, sous-unité catalytique (β) glycoprotéine qui fonctionne comme une flavodéshydrogénase et p22-phox (α) essentiel pour stabiliser l’hétérodimère α/β (stœchiométrie 1/1) ; p22-phox est un point d’ancrage majeur pour les facteurs cytosoliques d’activation qui sont les protéines régulatrices de l’oxydase. Ainsi le seul cytochrome b possède tous les éléments permettant un 558 transfert d’électron au travers de gp91-phox à partir de NADPH produit dans le cytoplasme (cycle des pentoses phosphate) jusqu’à l’oxygène qui est consommé — (respiration cellulaire) et réduit en ion O [13, 14].

2 La reconnaissance d’un élément pathogène (bactéries, champignons) ou la liaison d’un ligand soluble (médiateurs inflammatoires, ligands chimiotactiques, cytokines, etc.) au niveau de récepteurs de surface spécifiques des phagocytes [1] déclenchent une cascade de signalisation intracellulaire qui conduit au transfert des facteurs cytosoliques de régulation, à la membrane plasmique, puis à l’ancrage sur le cytochrome b . Un véritable édifice moléculaire se construit : il est stabilisé au 558 travers d’interactions spécifiques de type protéines/protéines ou protéines/lipides.

L’association de ces facteurs et plus particulièrement de p67-phox et Rac 1/2 au cytochrome b membranaire modifie son état conformationnel et induit une 558 transition entre l’état latent inactif (constituants dispersés) et un état activé (complexe assemblé), structure qui devient capable de transférer les électrons depuis NADPH jusqu’à l’oxygène (Figure 2) [15].

La mise en évidence des facteurs cytosoliques d’activation a bénéficié de la reconnaissance de plusieurs formes de granulomatose septique, CGD AR 47° et CGD AR 67° mais aussi de la capacité à reconstituer en milieu acellulaire une oxydase fonctionnelle. L’expérience consiste à incuber la membrane contenant le cytochrome b et le cytosol renfermant les facteurs de régulation, isolés respectivement 558 à partir des neutrophiles non stimulés avec un agent amphiphile, l’acide arachidonique [16]. De la même manière, il est possible de mettre en contact avec l’agent

FIG. 2. — Le complexe oxydase des phagocytes.

La NADPH oxydase des phagocytes est compartimentée et inactive dans les neutrophiles au repos (circulation). En réponse à un stimulus inflammatoire ou infectieux, les composants protéiques cytoplasmiques (p47-phox, p67-phox, p40-phox et Rac 1/2) s’associent au niveau membranaire sur le cytochrome b formé de 2 sous unités, gp91-phox et p22-phox. La NADPH oxydase 558 passe alors d’un état dormant à un état activé (complexe assemblé).

stimulant les constituants de l’oxydase purifiés sous forme native (cytochrome b ) 558 ou recombinante (facteurs cytosoliques) : la NADPH oxydase est ainsi reconstituée et retrouve ses capacités fonctionnelles [17]. Les protéines G monomériques Rac 1/2 sont des partenaires de choix dans cette activation. Les molécules amphiphiles miment l’action des phosphorylations qui, modifiant la charge des constituants, facilite leur assemblage sur le cytochrome b .

558 Granulomatose septique chronique

La granulomatose septique chronique ou « c hronic g ranulomatous d isease, CGD », est une maladie familiale « orpheline » (prévalence 1/250 000) [18]. Cliniquement, la granulomatose septique se traduit par des infections sévères et récidivantes avec fréquemment des foyers infectieux cutanés ou ganglionnaires (adénites) et des localisations viscérales diverses (pneumopathie, ostéoarthrite, abcès hépatique). La CGD doit son nom à la présence de ces foyers inflammatoires de type granulomateux dans les différents parenchymes. Les granulomes présentent des cellules géantes, multinuclées, résultat de la fusion de phagocytes ayant séquestré les bactéries non détruites.

TABLEAU 1. — Les différentes formes de granulomatose septique.

Constituents gp91 phox (Nox2) p22 phox p47 phox p67 phox

Genes CYBB CYBA NCF1 NCF2 Transmission liée à l’X Automosale et récessive Types de CGD X91o (55 %) CGD A22o (5 %) CGD A47o (30 %) CGD A67o (5 %) pathologie CGD X91— <5 %) CGD A22+ CGD A67— CGD X91+ (< 5 %) (1 cas) (1 cas) Les symptômes observés dans la CGD ont pour origine un dysfonctionnement du complexe de la NADPH oxydase qui est exprimé normalement dans les cellules phagocytaires principalement les neutrophiles mais aussi les monocytes et les macrophages. Ainsi les neutrophiles des patients atteints de CGD ont une incapacité à synthétiser les ions superoxyde et leurs dérivés qui sont les véritables armes bactéricides, oxydantes et toxiques. Dans 70 % des cas, la granulomatose septique est diagnostiquée avant l’âge de un an. Mais elle peut parfois être découverte à l’âge adulte [19].

Initialement décrite chez le garçon, elle a tout d’abord été considérée comme une maladie génétique de transmission liée à l’X. Par la suite des formes autosomales récessives affectant les deux sexes ont été mises en évidence. Le diagnostic de ces formes reste en moyenne plus tardif que les formes liées à l’X. Dans cette forme d’hérédité, CGD X, qui correspond à plus de 60 % des cas de CGD identifiés, les mutations sont observées dans le gène CYBB codant pour gp91-phox (Tableau I).

La majorité des mutations conduit à une perte d’expression de gp91-phox due à un défaut de synthèse de l’ARN messager ou à l’instabilité de la protéine mutée (tronquée ou mal conformée) qui sera rapidement éliminée.

Dans la forme autosomale, les mutations sont observées dans l’un des gènes NCF1 ,

NCF2 , et CYBA qui codent respectivement pour les protéines p47-phox, p67-phox ou p22-phox. Aucun cas de CGD liée à l’absence de p40-phox n’a été rapporté, mais par contre dans la CGD AR 67°, l’expression de p40-phox peut être fortement diminuée [résultats non publiés]. Dans un modèle de souris transgéniques invalidées pour le gène codant p40-phox, l’expression de p67-phox est également diminuée de manière significative [20], suggérant que p40-phox est un élément essentiel dans le fonctionnement de la NADPH oxydase et la bactéricidie des phagocytes.

Nous avons rapporté onze cas de granulomatose septique dont les patients, tous de sexe masculin, répondent à la classification X91°, X91— ou X91+ selon le taux d’expression du cytochrome b et l’activité NADPH oxydase catalysée [21]. Les 558 formes variantes X91— et X91+ caractérisées par une production normale (ou diminuée) de la protéine mutée inactive représentent des modèles d’étude particulièrement intéressants pour comprendre les bases moléculaires du dysfonctionnement de la NADPH oxydase dans cette maladie et les liens existant entre un domaine spécifique de la protéine et la fonction exercée [22, 23].

Quel que soit le gène muté,

CYBB codant pour gp91-phox (β) (CGD liée à l’X), ou

CYBA codant pour p22-phox (α) (CGD autosomale), les deux sous-unités du cytochrome b , α et β sont absentes, suggérant une stabilisation mutuelle dans les 558 neutrophiles de ces deux protéines [21, 24].

La prise en charge des patients atteints de CGD est essentiellement prophylactique :

anti-biothérapie antifongique et antibactérienne, administrée à forte dose et prolongée, accompagnée d’injections régulières d’interféron γ dispensé à vie. Une transplantation médullaire allogénique peut être proposée dans les formes très sévères ne répondant plus au traitement prophylactique ; bien qu’elle constitue un traitement définitif, la transplantation médullaire reste encore associée à une morbidité et une mortalité élevées [25]. De plus la pénurie de donneurs compatibles en diminue la fréquence.

La CGD semble être un candidat idéal pour la thérapie génique. En effet, les observations cliniques montrent qu’un faible pourcentage de neutrophiles fonctionnels suffit pour protéger les patients contre les infections. Par ailleurs, l’organe cible, la moelle osseuse est facilement accessible.

En 1997 un essai clinique de thérapie génique a été réalisé chez des patients atteints de CGD déficients en p47-phox sans conditionnement préalable de la moelle osseuse [26]. Dernièrement un second essai a été réalisé en Allemagne sur deux patients atteints de CGD X91° avec conditionnement de la moelle : les résultats obtenus se sont avérés encourageants [27]. Cependant bien que cette dernière approche thérapeutique soit novatrice et prometteuse, elle reste contraignante pour sa mise en œuvre et non dénuée de risques pour le patient. Par ailleurs, à l’exception des mutations identifiées sur le gène NCF1 (p47phox) chaque défaut génique à l’origine de la maladie est quasiment unique.

Le complexe oxydase des phagocytes, modèle d’assemblage biologique.

Pour reconstruire une oxydase fonctionnelle chez les patients atteints de granulomatose septique, il faut connaître les mécanismes moléculaires qui aboutissent à l’assemblage de plusieurs protéines destinées à exercer une fonction en réponse à une stimulation cellulaire inflammatoire ou infectieuse.

Le cytochrome b est l’oxydase en charge du transfert d’électrons mais son activité 558 est conditionnée par l’association des facteurs cytosoliques d’activation. Cette association est liée à des modifications de charges des constituants qui conduisent à des interactions spécifiques mais transitoires.

Dans les travaux que nous développons, nous cherchons à appréhender la topologie tridimensionnelle du cytochrome b membranaire dans sa configuration active.

558 Pour cette approche, l’analyse du cytochrome b normal et muté (CGD X — et 558 CGD X+) est primordiale.

Nous avons donc isolé et purifié le cytochrome b à partir de neutrophiles humains 558 ou de lymphocytes B-EBV [10, 28] et reconstruit un système oxydase fonctionnel en

FIG. 3. — Analyse topographique par Microscopie à Force Atomique (AFM) de liposomes de cytochrome b avant et après assemblage de la NADPH oxydase.

558 La NADPH oxydase est reconstituée en milieu acellulaire : une fraction aliquote du milieu de reconstitution contenant le cytochrome b purifié (0,2 pmoles) à partir des neutrophiles 558 humains et incorporé dans des liposomes et le cytosol des neutrophiles (300 µg), est prélevée avant et après addition d’acide arachidonique (60 nmol) l’agent stimulant, puis étalée sur une surface de mica et séchée pour être observée par AFM. Le changement de hauteur des liposomes contenant le cytochrome b suggère que les différents constituants se sont assemblés sur le 558 cytochrome b , après activation par l’acide arachidonique.

558 milieu acellulaire. Nous avons alors révélé par Microscopie à Force Atomique (AFM), une modification de conformation du cytochrome b après activation 558 (Figure 3) [15]. L’impact du facteur p67-phox dans cet assemblage a été confirmé dans une forme de CGD AR 67° [29] : il est possible en effet de complémenter in vitro le cytosol des lymphocytes B-EBV provenant de patients déficients en facteur p67-phox, par la protéine manquante préparée sous forme recombinante [30, 31].

Nous avons démontré par ailleurs, que si p67-phox est nécessaire et suffisant dans l’assemblage du complexe oxydase et son activation, p47-phox qui peut isolément s’associer au cytochrome b n’induit pas d’activation [15] ; il est maintenant 558 clairement établi que le facteur p47-phox ne jouerait pas de rôle direct mais servirait de protéine adaptatrice, indispensable in vivo , pour favoriser le bon ajustement de p67-phox sur le cytochrome b et atteindre une activation optimale de l’oxydase.

558 Ceci est confirmé par le fait que la CGD AR 47° présente des formes cliniques moins sévères que les autres. Ces éléments démontrent que l’activité oxydase est déclenchée lorsque p67-phox vient se lier au cytochrome b suggérant qu’il pourrait induire le 558 changement de conformation de l’hémoprotéine, la rendant apte au transfert d’électrons [32].

Dans les années 1980, différents groupes ont tenté de purifier la NADPH oxydase des phagocytes dans sa forme active, à partir de membrane de neutrophiles stimulés [13, 14]. Mais l’activité oxydase de la protéine isolée était particulièrement faible vraisemblablement en raison de son instabilité ou de la perte des facteurs régulateurs
que l’on ne connaissait pas à l’époque, au cours de l’extraction en détergent et du fractionnement protéique. A la même période le cytochrome b nouvellement 558 identifié était purifié [14, 28, 33]. Par la suite la reconstitution in vitro d’une oxydase fonctionnelle a permis l’analyse d’une fonction dont le caractère inductible a été remis récemment en question [34].

Nous avons isolé pour la 1ère fois, le complexe assemblé et actif de la NADPH oxydase des neutrophiles, sur une matrice d’affinité au cours de la purification du cytochrome b mis en présence des facteurs cytosoliques (cytosol). On observe que 558 l’activité de cette oxydase est mesurable en l’absence d’agent stimulant (acide arachidonique), elle est donc constitutive. Par ailleurs, elle peut atteindre des valeurs optimales à l’image de ce que l’on obtient dans les neutrophiles natifs stimulés [35].

Les résultats suggèrent que le complexe oxydase construit sur la matrice d’affinité présente une configuration adaptée à sa fonction. Les partenaires présents dans ce complexe et acteurs de cette activité ont été identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF. On trouve les deux sous-unités du cytochrome b , les facteurs 558 cytosoliques d’activation, p67-phox, p47-phox, p40-phox et Rac, mais également deux protéines du cytosquelette, moésine et coronine préalablement pressenties pour participer à l’activation, et deux enzymes de régulation du métabolisme des glucides dont le rôle est primordial pour favoriser dans les neutrophiles la production de NADPH, substrat de l’oxydase. Les résultats obtenus par la suite ont mis l’accent sur différents niveaux d’activation et donc d’activité suggérant un changement conformationnel progressif du cytochrome b , au cours de la transition entre 558 la forme dormante (inactive) de la NADPH oxydase et le complexe assemblé (actif) (Figure 4) [35]. On a pu démontrer également que des protéines à calcium de la lignée myéloïde MRP8, MRP14, « Myeloïd Related Protein » jouent un rôle clé dans les mécanismes de régulation en s’associant directement au cytochrome b558 [32] et en potentialisant l’activité oxydase catalysée. Ces travaux nous ont permis de conclure qu’en fait, c’est le changement de conformation du cytochrome b qui 558 initie le transfert d’électrons.

Perspectives d’avenir.

Compte tenu du caractère ubiquitaire de la famille des NADPH oxydases et des connaissances acquises concernant les mécanismes de fonctionnement des Nox, il est possible maintenant d’envisager de nouvelles approches pour le traitement de la granulomatose septique particulièrement la CGD X91°, mais aussi des maladies inflammatoires (arthrose) ou du vieillissement (développement tumoral) dans lesquelles les radicaux oxydants formés à partir de O — sont produits en excès. Il faut 2 donc, selon les cas, « complémenter » des cellules déficientes et restaurer une activité NADPH oxydase normale ou au contraire mettre en œuvre une stratégie d’inhibition pour bloquer une activité NADPH oxydase excessive.

En ce qui concerne la CGD et la thérapie des maladies héréditaires, il ne faut pas se restreindre à une seule approche. En effet, la stratégie de thérapie génique entreprise

FIG. 4. — États conformationnels du cytochrome b identifiés au cours de l’activation de la 558 NADPH oxydase.

Les différents états d’activation des complexes NADPH oxydase suggèrent une progression dans le changement d’état conformationel du cytochrome b au cours de la transition entre une 558 oxydase totalement inactive et une oxydase pleinement fonctionnelle.

dans la granulomatose septique ne conduit pas encore à un taux de correction suffisant des neutrophiles. Nous orientons donc les recherches vers un nouveau concept de thérapie, l’idée étant de développer des protéines à visée thérapeutique et de les transférer directement dans les cellules déficientes pour court-circuiter l’étape de transcription du gène et de sa traduction.

Centrés sur l’étude des modalités de transfert de la « protéine médicament » au travers des membranes cellulaires, les premiers travaux que nous avons réalisés dans la CGD p67° à l’aide du système de sécrétion des toxines bactériennes, nous ont permis de démontrer qu’il était possible de transférer dans des lymphocytes B déficients en facteur p67-phox, la protéine manquante et de restaurer dans ces cellules, une activité NADPH oxydase suffisante [31]. Nous développons maintenant dans la granulomatose septique CGD X91° un nouveau concept de transfert.

A cet effet le cytochrome b est préparé sous forme recombinante et sera intégré 558 dans la membrane cellulaire sous la forme de protéoliposomes qui sont des molé- cules hydrophobes. Sous cette forme, le protéoliposome sera utilisé comme agent thérapeutique dans un modèle cellulaire proche du neutrophile, lignée cellulaire PLB 985 X91°. Après validation, cette stratégie sera expérimentée par la suite sur des modèles animaux de souris transgéniques invalidées pour le gène. La première étape de cette stratégie (préparation des protéoliposomes) est en cours.

REMERCIEMENTS

Les recherches sur la NADPH oxydase des phagocytes et la granulomatose septique ont été effectuées par : S. Berthier, Y. Campion, B. Lardy, J.L. Lenormand, B. Marquès, M.H.

Paclet, B. Polack, M.J. Stasia, et S. Vergnaud que je tiens à remercier vivement, ainsi que A. Claraz et L. Laval pour le travail dactylographique et l’iconographie et G. Butt pour les corrections d’anglais. Ces travaux ont été réalisés avec l’aide de la « Direction Régionale de la Recherche Clinique » CHU, Grenoble, la Région Rhône-Alpes, « programme émergence 2003 », le « CGD Research Trust », programme européen 2006.

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558 DISCUSSION

M. Bernard SALLE

Est-il possible d’avoir un diagnostic prénatal lorsqu’un enfant est atteint puisque c’est une maladie héréditaire ? Si le diagnostic est fait en anténatal, quelle est l’attitude vis-à-vis des parents ?

Le diagnostic prénatal est réalisé en collaboration avec les laboratoires de génétique agréés des centres hospitaliers soignant les patients atteints de CGD. Ce sont donc les cliniciens de ces centres qui sont en interface avec les patients et leur famille. Dernièrement un tel diagnostic a été réalisé pour une famille expertisée dans notre laboratoire en collaboration avec le CHU de Marseille. Pour ce qui est du CHU de Grenoble et à partir du laboratoire d’enzymologie un « centre de diagnostic agréé et de recherche sur la granulomatose septique » a été identifié comme centre de compétence depuis le 1er janvier 2007. Les membres de ce nouveau laboratoire sont en lien permanent avec les médecins prescripteurs. Ce centre est enregistré dans la base Orphanet nationale et européenne. Par ailleurs, un site Web sur la granulomatose septique a été créé en 2002.

M. Michel BOUREL

Combien de cas de GSC avez-vous dans vos cohortes de malades ? Quelles variétés de mycoses avez-vous observées ? Et quelles sont les plus fréquentes ?

D’après une base de données européennes réalisée par le Professeur D. Roos à Amsterdam, l’activité du laboratoire d’enzymologie en terme de diagnostic de la CGD évaluée à fin 2006, au CHU de Grenoble représente 40 % des cas diagnostiqués en France. Les formes de granulomatose septique les plus fréquemment rencontrées sont de type CGD X° avec 60 % des cas identifiés. Au plan clinique, les mycoses observées sont le plus souvent des aspergilloses.

M. Pierre GODEAU

Ayant observé, de façon fortuite, deux cas de lupus érythémateux dans deux familles différentes où la mère était atteinte de granulomatose septique, il semble qu’il s’agisse de
faits rares certes, mais connus. En avez-vous observé ? Quel est le mécanisme de la transmission génétique de tels cas ?

Il a été effectivement rapporté et décrit des cas de lupus érythémateux chez des patients atteints de granulomatose septique. Nous n’avons jamais eu de telles observations.

M. Jean COSTENTIN

Voudriez-vous s’il vous plaît commenter le concept de respiration cellulaire des polynucléaires ? S’agissant de la thérapie par transfert de protéines, quelles sont les modalités et quelles sont les applications actuelles ?

Respiration cellulaire : Dans les polynucléaires neutrophiles, il n’y a pas de mitochondries fonctionnelles. L’oxygène qui sature le milieu est donc consommé par la NADPH oxydase lorsque les neutrophiles sont stimulés par des bactéries ou des médiateurs inflammatoires (ligands chimiotactiques). La respiration cellulaire engendrée est foudroyante ; elle est à l’origine d’une production massive d’ion superoxyde O .-. Thérapie 2 par transfert de protéines : La thérapie par transfert de protéines est mise en œuvre dans le groupe européen « Hum Pro Ther » (responsable J.L. Lenormand, GREPI). En partenariat avec cette équipe, nous développons le projet intitulé : « perspectives de traitement par transfert de protéines dans la granulomatose septique CGD X° ». Dans cette forme de CGD, le gène qui code la sous-unité gp91-phox est muté et le cytochrome b est absent. Dans ce contexte l’approche thérapeutique consiste à transférer directe558 ment la protéine médicament dans la cellule déficiente : ici le cytochrome b est l’agent 558 thérapeutique. Chacune des sous unités du cytochrome b est préparée sous forme 558 recombinante. Le cytochrome b sera par la suite inséré dans des liposomes puis intégré 558 au niveau membranaire ; ces protéoliposomes sont donc les vecteurs de transfert.Les cellules cibles sont proches des neutrophiles et proviennent d’une lignée cellulaire PLB 985 X°. Les perspectives de développement de cette nouvelle approche thérapeutique dans le groupe « Hum Pro Ther » concernent la cancérologie et la médecine infectieuse.

M. Jean-Yves LE GALL

Connaît-on des polymorphismes génétiques dans les gènes codant les différents constituants du complexe ‘‘ NADPH oxydase ’’ et, si oui, sont-ils susceptibles d’expliquer une sensibilité particulière à certaines infections ? Les gènes du complexe NOX sont exprimés dans différents types cellulaires autre que les phagocytes. Connaît-on leurs rôles biologiques ?

Polymorphisme génétique : quatre gènes sont impliqués dans la granulomatose septique CYBB, CYBA, NCF1 et NCF2 codant respectivement pour gp91-phox, p22-phox, p47-phox et p67-phox. Il n’existe pas de localisation préférentielle des mutations dans ces gènes sauf en ce qui concerne le gène NCF1 qui code pour la protéine p47-phox (la même mutation étant généralement retrouvée). Ceci est du à l’existence d’un pseudogène.

Seulement quatre polymorphismes ont été trouvés sur le gène CYBB codant pour gp91-phox. Dans ce cas, il n’y a pas de sensibilité particulière aux infections. Les Nox : la famille des NADPH oxydases Nox comprend sept membres exprimés en particulier dans le colon, l’oreille interne, le rein, le cartilage, les tissus lymphoïdes et la rate. Dans les cellules de ces tissus (endothéliales, épithéliales, fibroblastiques, chondrocytes, lymphocytes B etc.) les Nox génèrent des taux très faibles d’ions superoxyde O — (concentration 2 environ 200 fois inférieure à ce qui est mesuré dans les neutrophiles stimulés). Les
radicaux oxydants produits à partir de O —, les ROS, sont reconnus maintenant pour 2 avoir une fonction ciblée sur la transduction du signal et le remodelage matriciel de la matrice extracellulaire. Les cibles peuvent être des facteurs de transcription (NF-κB, AP1) sensibles à l’équilibre redox. Les radicaux oxydants peuvent aussi jouer un rôle métabolique : c’est le cas des « Duox » dans la thyroïde.

M. Paul VERT

Dans le décryptage du mécanisme de la bactéricidie du polynucléaire qui met en œuvre la production de l’anion superoxyde et d’une série d’espèces réactives (ROS) vous situez le rôle stimulant de l’acide arachidonique. Est-ce que la prescription d’inhibiteurs de la synthèse de la cyclo-oxygénase (COX 1 ou COX 2) comme l’indométacine et l’ibuprofène est de nature à altérer le complexe NADPH oxydase donc la fonction bactéricide de ces cellules ? Il est connu que différentes fonctions du polynucléaire sont déficientes chez le nouveau-né. Qu’en est-il de la maturation de la NADPH oxydase ?

Acide arachidonique : l’acide arachidonique est secrété par la phospholipase A2 dans les neutrophiles stimulés mais les faibles concentrations mesurées ne permettent pas d’imaginer que l’action inhibitrice de la synthèse de la cyclo-oxygénase puisse altérer l’activité bactéricide des phagocytes dans le contexte d’une explosion respiratoire et d’une production massive de radicaux oxydants, les ROS. Par ailleurs, les radicaux oxydants ne sont pas les seuls protagonistes de la bactéricidie. Maturation de la NADPH oxydase : il a été observé des différences d’activité NADPH oxydase entre les polynucléaires neutrophiles de sang de cordon, du nouveau-né et ceux de l’adulte. Ces observations conduisent à la plus grande prudence dans l’évaluation de l’activité NADPH oxydase et à son nécessaire contrôle quelques mois après la naissance. Par ailleurs, il convient d’utiliser plusieurs approches techniques et surtout différentes modalités de stimulation des neutrophiles pour mesurer l’activité.

Bull. Acad. Natle Méd., 2007, 191, no 2, 377-392, séance du 27 février 2007