INTRODUCTION

L’évolution semble nous avoir fait perdre les formidables capacités régénératrices de beaucoup de nos vieux ancêtres, comme le triton ou l’hydre. Coupez la tête d’une hydre, pas seulement celle de Lerne, et elle régénèrera ! Si la plupart des tissus des mammifères ont perdu cette faculté de reconstruction, le foie l’a conservée. Ainsi, la régénération hépatique pourrait être assimilée à la régénération du cœur des tritons au cours de laquelle les cardiomyocytes adultes, après lésion cardiaque, entrent en cycle, sans perdre certaines de leurs fonctions de différenciation [1]. Pourtant connue depuis l’Antiquité par le mythe de Prométhée, cette capacité du foie à régénérer n’a été utilisée que récemment en pratique médicale : c’est en effet parce que le foie régénère qu’il est possible de pratiquer une hépatectomie après embolisation portale chez des patients présentant des métastases hépatiques bilobaires d’un cancer colorectal ou un carcinome hépatocellulaire.

Dans des conditions physiologiques, le foie est un organe quiescent. La longévité d’un hépatocyte est d’environ 200 à 400 jours. Le modèle d’étude par excellence des mécanismes impliqués au cours de la régénération du foie est l’hépatectomie des 2/3 chez le petit rongeur [2]. Au décours de cette procédure, 85 % des hépatocytes restants entrent en cycle de manière quasi-synchrone. Les lobes hépatiques résiduels s’hypertrophient progressivement pour restituer la masse hépatique initiale fi10 %.

Les composants de la matrice extracellulaire sont rapidement dégradés et la synthèse d’une nouvelle matrice coïncidera avec le retour des hépatocytes en quiescence.

Chez la souris ou le rat, le processus est donc achevé en 7 à 14 jours. Les premières cellules à se diviser sont les hépatocytes et, en premier lieu, ceux qui sont en position périportale. Viennent ensuite les cellules biliaires, les cellules de Küpffer et enfin les cellules endothéliales sinusoïdales. Cette cinétique initiée par les hépatocytes les place au cœur du processus de régénération. La vitesse de progression des hépatocytes à travers le cycle cellulaire dépend de l’espèce étudiée. La durée du cycle est en effet conservée lorsque les hépatocytes d’une espèce sont transplantés en situation xénogénique, suggérant que des facteurs intrinsèques à la cellule gouvernent cette horloge biologique [3]. Enfin, le cycle hépatocytaire est soumis à un rythme circadien dont les mécanismes moléculaires ne sont pas encore élucidés.

LA THÉRAPIE CELLULAIRE : UNE ALTERNARIVE À LA TRANSPLANTATION D’ORGANE ?

La transplantation hépatique orthotopique (THO) dont la première pratique chez l’homme date de 1963, est longtemps apparue comme le seul traitement de nombreuses affections métaboliques ou acquises du foie, parvenues à un stade avancé.

Du fait de la morbidité associée à ce type d’intervention, de la nécessité d’une immunothérapie au long cours et de la pénurie d’organes, certains auteurs ont proposé la transplantation d’hépatocytes isolés (THI) comme alternative à la THO.

En théorie, la THI serait moins invasive et moins lourde chirurgicalement que la THO, surtout si une voie percutanée de transplantation peut être proposée. Des expériences de transplantations d’hépatocytes isolés en série révèlent chez le rongeur que les hépatocytes peuvent se diviser plus de 80 fois alors que seule une vingtaine de divisions devrait suffire pour reconstituer un foie de souris à partir d’un hépatocyte [4] ! Tous les hépatocytes sont doués de capacités prolifératives, qu’ils soient diploï- des, tétraploïdes ou même octaploïdes. Seul semble compter le ratio entre besoins de l’organisme et ce que peut offrir le foie. En étant un peu provocateur, on pourrait donc considérer l’hépatocyte comme une cellule souche monopotente !

Les indications de la THI peuvent couvrir un large spectre allant de certaines maladies génétiques, métaboliques touchant le foie comme l’amyloïdose familiale, l’hémochromatose ou la maladie de Crigler Najjar aux hépatites fulminantes dans l’attente d’une THO. Dans ces cas, le remplacement sélectif d’une partie seulement des hépatocytes pourrait suffire à obtenir un effet bénéfique. Les maladies extrahépatiques avec déficit en une protéine circulante comme certaines hypercholesté- rolémies familiales ou certains troubles de l’hémostase représentent une autre indication. La THI a alors sur la THO l’avantage d’autoriser une autogreffe d’hépatocytes génétiquement modifiés et donc de s’affranchir d’un traitement immunosuppresseur lourd. Pourtant, très peu d’essais cliniques font état de résultats thérapeutiques objectifs après transplantation d’hépatocytes isolés. Les raisons de ces échecs sont imputables non seulement à la difficulté de faire se multiplier les hépatocytes en culture, mais surtout d’implanter une proportion suffisante d’hépatocytes et à leur absence de prolifération au sein du parenchyme receveur. Un concept à la base des stratégies de repeuplement du foie qui visent à conférer un avantage sélectif aux cellules transplantées a alors été proposé. Celui-ci s’inscrit dans le cadre plus général des approches thérapeutiques de la médecine régénératrice de demain.

LES ESSAIS CLINIQUES DE TRANSPLANTATION D’HÉPATOCYTES ISOLÉS

La proportion maximale d’hépatocytes que l’on puisse transplanter chez l’homme pour minimiser les complications liées à l’injection a été estimée à moins de 5 % de la masse hépatique. Des résultats objectifs ont néanmoins été obtenus dans quelques cas de maladies métaboliques. Chez une patiente présentant une maladie de CriglerNajjar de type I (déficit en UDP-glycuronyltransférase essentielle à la glycuroconjugaison et à l’excrétion de la bilirubine), la transplantation de 7,5 milliards d’hépatocytes allogéniques par voie portale a conduit à une diminution sensible du taux de bilirubine plasmatique durant plus d’un an et à l’apparition dans la bile de bilirubine conjuguée permettant de raccourcir la durée des séances de photothérapie [5].

Néanmoins, cette patiente a par la suite subi une transplantation hépatique. Des résultats partiels ont été également obtenus dans un cas de glycogénose de type I [6]
ou de déficit en ornityl transcarbamylase [7]. Enfin, dans le cadre d’une autogreffe d’hépatocytes génétiquement modifiés, un essai clinique portant sur 5 patients atteints d’un déficit en récepteur de rLDL a montré que le remplacement d’environ 1 % des hépatocytes induisait une diminution modeste mais prolongée des niveaux de cholestérol plasmatiques chez trois des patients [8].

Devant ces résultats décevants, certains auteurs ont alors voulu mettre à profit l’extraordinaire capacité proliférative des hépatocytes adultes pour augmenter l’effet thérapeutique en stimulant in vivo leur prolifération par voie chimique ou chirurgicale. Cependant, le stimulus agissant aussi bien sur les hépatocytes du receveur que sur les hépatocytes transplantés, l’avantage donné par la prolifération des hépatocytes thérapeutiques est minime [9].

LE CONCEPT DE REPEUPLEMENT DU FOIE

Modèles spontanés

Le concept de repeuplement découle notamment de l’observation de patients atteints de tyrosinémie héréditaire par déficit en fumaryl-acétoacétate hydrolase (FAH). La FAH est l’enzyme terminale du métabolisme de la tyrosine et son déficit conduit à l’accumulation intracellulaire de fumarylacétoacétate et de son précurseur, le maleylacétoacétate. En absence de transplantation hépatique ou de traitement par le 2-(2-nitro-4-trifluoro-méthylbenzoyl)-1,3-cyclohéxanedione (NTBC), l’accumulation de ces métabolites conduit à une cytolyse hépatique chronique. Or, certains de ces patients présentent des nodules de régénération spontanés exprimant la FAH [10]. Ainsi, tout se passe donc comme si ces hépatocytes exprimant de novo l’enzyme FAH avaient, sur les hépatocytes déficients qui ne l’expriment pas un avantage de survie leur permettant de repeupler progressivement le foie des patients.

Deux critères sont donc requis pour rendre compte de l’efficacité des cellules potentiellement thérapeutiques en matière de régénération du foie : — les cellules transplantées doivent présenter un avantage sélectif sur les cellules résidantes et — les cellules résidantes être éliminées au fur et à mesure que les cellules transplantées prolifèrent. Néanmoins, dans le modèle décrit ci-dessus, l’élimination des cellules résidantes est due à l’accumulation des substrats d’amont, limitant ainsi l’application thérapeutique de cette approche à ce modèle spécifique.

Modèles induits

Afin d’étendre ce concept à d’autres affections, nous avons développé un modèle expérimental démontrant qu’il est possible de repeupler un foie normal de souris en conférant un avantage sélectif de survie aux hépatocytes transplantés. Le foie est un organe sensible à l’apoptose médiée par la voie de Fas. Des hépatocytes exprimant le facteur anti-apoptotique Bcl-2 sont protégés de cette mort cellulaire programmée
induite par un anticorps agoniste de la voie de Fas (anticorps Jo2) [11]. La transplantation d’un million d’hépatocytes transgéniques Bcl-2 dans le foie de souris normales soumises à une apoptose ménagée répétée et médiée par cet anticorps, permet d’obtenir en huit semaines un repeuplement progressif atteignant 16 à 30 % de la totalité des hépatocytes. Par la suite, nous avons utilisé un vecteur viral exprimant à la fois le gène conférant l’avantage sélectif, Bcl2, et un gène traceur, la green fluorescent protein (GFP), dans le but de directement transduire et sélectionner in vivo une petite proportion d’hépatocytes, amenés par la suite à se multiplier au sein du parenchyme hépatique. Les cellules initialement infectées par le rétrovirus, 1 % des hépatocytes environ, représentent plus de 80 % d’entre eux après deux mois d’un traitement apoptotique hebdomadaire [12]. Pour démontrer la valeur thérapeutique de cette approche, nous l’avons transposée au modèle murin d’hypercholestérolémie par déficit en apolipoprotéine E. Deux mois après la transplantation, le taux de cholestérol des animaux transplantés est nettement diminué et le profil lipidique des animaux est proche de la normale. Cette diminution est corrélée au niveau de sécrétion de l’apolipoprotéine E dans le serum des animaux et s’accompagne d’une baisse significative des lésions d’athérosclérose artérielle classiquement retrouvées dans ce modèle [13]. Ces résultats prouvent non seulement la valeur thérapeutique de la stratégie mais démontrent la fonctionnalité des hépatocytes qui ont repeuplé le foie. Ils apportent donc la preuve de principe de la faisabilité et de l’efficacité d’une approche de prolifération sélective de cellules thérapeutiques et ouvrent par consé- quent d’incontestables possibilités thérapeutiques jusque-là non entrevues, non seulement pour des maladies spécifiquement hépatiques mais également, plus largement, pour des affections nécessitant la sécrétion d’une protéine circulante.

QUELLES CELLULES SOUCHES ADULTES : HÉPATOCYTES, CELLULES OVALES OU CELLULES MÉDULLAIRES ?

Ce n’est que dans des conditions physiopathologiques particulières, notamment lorsque la capacité proliférative des hépatocytes est bloquée, par exemple par des agents chimiques ou au cours de régimes déficients en choline, qu’apparaissent des cellules basophiles appelées, sur des critères morphologiques, cellules ovales. Ces cellules épithéliales hépatiques ont un double potentiel biliaire et hépatocytaire in vivo . Elles ont été décrites en situation périportale, à proximité du ductule biliaire, dans une structure appelée canal de Hering . Chez l’homme, une prolifération de cellules ovales est observée au cours des nécroses hépatiques massives [14] et dans certaines hépatopathies chroniques. L’implication de ces cellules souches au cours de la régénération du foie est très controversée. En effet, aucune population cellulaire homogène de cellules ovales n’a, jusqu’à présent, été isolée. Ces cellules partagent certains marqueurs, comme OV6 et CK9, avec les hépatoblastes et d’autres comme Sca-1, c-kit, CD34 ou Thy1 avec les cellules souches hématopoié- tiques (CSH). La présence de marqueurs antigéniques communs aux CSH et aux cellules ovales ainsi que l’observation d’une différenciation potentielle après greffe
de moelle de cellules hématopoiétiques en cellules ovales ont fait proposer une origine commune à ces deux types cellulaires [15]. Ce lignage est néanmoins démenti par l’équipe de M. Grompe [16]. Plus de 50 ans après leur première description par Farber [17], on ne sait toujours pas si ces cellules sont des cellules souches résidant dans le foie ou si elles dérivent d’un progéniteur circulant plus immature. Leur implication dans certains cholangiocarcinomes limite en tout cas leur utilisation thérapeutique potentielle.

Existe-t-il une niche de cellules souches capables de supplanter l’hépatocyte dans un protocole de thérapie cellulaire ou de reconstitution d’organe ? Nous n’aborderons ici que la notion de cellules souches post-natales et écarterons les cellules fœtales.

Différents travaux ont tenté de démontrer la capacité de différenciation hépatocytaire de cellules médullaires adultes [18-19]. Cependant, l’efficacité de cet événement et sa pertinence physiologique, plus de quatre ans après sa description, restent encore débattues.

Pour étudier cette question, nous avons transplanté des cellules médullaires d’animaux transgéniques exprimant Bcl-2 sous le contrôle d’un promoteur hépatospécifique chez des souris normales irradiées. Dans l’hypothèse d’une transdifférenciation de cellules médullaires en hépatocytes, une expression hépatique du transgène Bcl-2 doit être détectée après transplantation de moelle d’animaux transgéniques chez la souris normale. Or, en absence de lésions induites par la voie de Fas, aucune expression n’a pu être détectée. En revanche une expression a été détectée après quelques semaines de traitement pro-apoptotique. Nous avons estimé à moins de 1 cellule sur 105 la fréquence de cet événement. À titre comparatif, alors que la transplantation d’un million d’hépatocytes permet en deux mois d’atteindre plus de 30 % de repeuplement du foie receveur, celle d’un million de cellules médullaires ne permet pas de dépasser 1 % des hépatocytes de l’animal au terme d’une période de sélection équivalente [20]. Ces données illustrent la rareté de l’évènement de « transdifférenciation » et suggèrent que l’on comprenne mieux les mécanismes qui le sous-tendent avant d’envisager leur utilisation thérapeutique. Des données expérimentales récentes suggèrent que cet événement rare de différenciation moelle-foie [21] est le fruit d’une fusion entre un progéniteur myélomonocytaire et un hépatocyte résidant [22], remettant en cause la notion même de plasticité. Pourtant, différents travaux rapportent l’obtention de cellules hépatiques à partir du compartiment mésenchymateux de la moelle et non du compartiment hématopoiétique. Un nouveau type cellulaire appelé MAPC pour Multipotent Adult Progenitor Cells a été decrit par le groupe de C. Verfaillie [23-25]. Les caractéristiques de cette cellule la rapprochent plus d’une cellule ES que d’une cellule pluripotente. En effet, ces MAPC se divisent plus de 100 fois sans que l’on observe un raccourcissement de leurs télomères et partagent avec les cellules ES l’expression de marqueurs moléculaires spécifiques de ces dernières, Oct4 et Rex. Ces cellules sont capables de différenciation in vitro en de nombreux tissus des trois feuillets embryonnaires et, injectées in vivo , colonisent de nombreux tissus. Cependant, contrairement aux cellules ES, elles ne semblent pas entraîner de développement tumoral lorsqu’elles
sont directement injectées in vivo à l’animal. Ces différentes caractéristiques plaçaient jusqu’à présent ce nouveau type cellulaire au premier rang du box office des cellules souches ! Cependant, la démonstration de leur potentiel thérapeutique se fait toujours attendre… Plus récemment, d’autres groupes ont décrit des capacités de différenciation hépatocytaire de différentes cellules issues du compartiment mésenchymayteux ajoutant encore à la confusion [26-27]. L’heure a sonné de comparer ces types cellulaires afin de déterminer s’ils sont apparentés et de démontrer qu’ils ont un réel potentiel pour la régénération thérapeutique du foie.

CONCLUSION

La recherche d’une cellule souche universelle est un peu comme la quête du Graal, passionnante mais incertaine. L’hépatocyte semble encore à ce jour la cellule la plus efficace pour régénérer un foie. Nous avons contribué à démontrer qu’un avantage sélectif conféré à ces cellules permettait d’augmenter drastiquement le potentiel thérapeutique d’une approche de thérapie cellulaire. Cependant, cette stratégie nécessite que les cellules résidantes soient progressivement éliminées pour laisser place aux cellules thérapeutiques. Or, dans la plupart des affections, le foie ne présente pas spontanément cette lyse chronique. L’implication de la voie de Fas dans des hépatites fulminantes chez l’homme rend impossible son utilisation en clinique et il est donc nécessaire de définir un couple « gène de survie/agent de cytolyse hépatique » cliniquement pertinent.

Quant aux autres cellules souches adultes capables de suppléer la fonction hépatocytaire, comme les cellules souches hématopoiétiques, certaines cellules souches mésenchymateuses ou stromales, il sera sans doute nécessaire de mieux comprendre les mécanismes qui président au contrôle de leur fusion, leur transdifférentiation et leur domiciliation avant de pouvoir les compter dans le répertoire des cellules thérapeutiques.

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