Les séances de l’Académie*
*Résumés rédigés par Catherine Adamsbaum, Bernard Bauduceau, Nathalie Cartier Lacave, Jacques Delarue, Jacques Hubert, Jean-Pierre Richer.
Mardi 14 janvier 2025
Séance dédiée :
« Cellules souches et organoïdes en endocrinologie : des innovations prometteuses »
Organisation : Jean-Louis Wémeau
Présentation par Jean-Louis WÉMEAU (Membre de l’ANM)
Il existe différentes variétés de cellules souches :
– Cellules-souches indifférenciées totipotentes, depuis le zygote jusqu’à la morula (4e jour), capables de conduire à un organisme entier. Ce modèle est non reproductible in vitro.
– Cellules-souches embryonnaires pluripotentes, au stade du blastocyste, depuis le 5e jour jusqu’à l’implantation. Elles s’auto-différencient dans les 3 couches de l’embryon.
– Cellules-souches multipotentes que l’on retrouve chez l’embryon, fœtus ou chez les adultes. Elles sont engagées dans un processus déterminé d’organogenèse.
– Cellules-souches unipotentes qui ne permettent le renouvellement que d’un seul type de cellules ; en leur absence il n’y pas de survenue de régénération cellulaire.
L’origine des cellules-souches dépend de leur type. Les cellules-souches embryonnaires sont prélevées à partir d’embryons congelés sains ou suspects de maladies (diagnostic préimplantatoire) surnuméraires au stade de blastocyste entre le 5e et le 7e jour suivant la fécondation. Les cellules-souches fœtales sont obtenues après IVG et sont abondantes dans le sang du cordon. Les cellules-souches tissulaires adultes qui ne permettent le renouvellement que d’un seul type de cellules sont présentes dans : tissu hématopoïétique, intestin, foie, peau, muscle squelettique, os et sont absentes du cœur, du pancréas et de la thyroïde.
Les cellules-souches pluripotentes induites ou iPS (induced pluripotent stem) ont été découvertes en 2006. Elles sont produites artificiellement dans des conditions de culture précises à partir de cellules matures, par reprogrammation génétique grâce à 4 facteurs de transcription retenus par Yamanaka (Tokyo, Prix Nobel 2012) : octamer-binding transcription factor 4 (Oct4), SRY-box 2 (Sox2), Kruppel-like factor 4 (Klf4), c-Myc. Elles ont le potentiel de se différencier en n’importe quelle cellule de l’organisme. Ce modèle expérimental a l’avantage de ne poser aucun problème éthique.
Les cellules-souches sont utilisées dans l’étude du développement normal et pathologique, aident à la compréhension des maladies génétiques, permettent l’étude de la sensibilité à l’influence de médicaments et sont aussi utilisées en thérapie cellulaire (auto-ou allogreffes médullaires, autogreffes cutanées en cas de brûlures étendues, et aussi cornée, rétine, neurales en médecine régénérative).
Elles sont cultivées à partir de tissus normaux (exposées à la sénescence) ou de tissu cancéreux (immortelles), en suspension, en monocouches 2D et depuis 2010 en 3D.
Les organoïdes sont des micro-tissus multicellulaires en 3D dérivés de cellules-souches et conçus pour imiter fidèlement la structure et la fonctionnalité complexes des organes humains. Ils utilisent des cellules-souches embryonnaires ou pluripotentes induites et s’auto-organisent dans l’espace en 3D et peuvent par ex reproduire la sécrétion humorale et hormonale, en étant cependant dépourvus d’innervation. D’une manière générale, ils sont utilisés pour l’étude du développement et de l’organogenèse, la modélisation de maladies, la reconstitution d’organes complets utilisables pour la greffe, permettent l’analyse de l’effet de nutriments, médicaments ou d’événements liés à l’environnement. S’ils ont réduit l’expérimentation animale en permettant des essais préalables et en réduisant des expériences in vivo, ils ne permettent pas la reproduction complète d’un organisme entier.
Communications
Organoïdes hypothalamo-hypophysaires comme modèles pathologiques par Thierry BRUE (Service d’Endocrinologie, Hôpital de la Conception, APHM, Centre de Référence des Maladies Rares hypophysaires HYPO ; Laboratoire de Génétique Médicale de Marseille (MMG, UMR1251), INSERM et Aix Marseille Université, Institut Marseille maladies rares MarMaRa
Les causes de déficit en ACTH sont multiples : post-corticothérapie, tumeurs (adénomes, craniopharyngiomes…), radiothérapie, hypophysite …et plus rarement congénital.
Jusqu’en 2001, seules 2 mutations autosomiques récessives responsables du déficit corticotrope isolé congénital étaient connues : pro-opio-mélanocortine (POMC) associé à une obésité sévère et une pigmentation anormale et PC-1 associé à une obésité sévère. Le déficit isolé en ACTH est une affection potentiellement mortelle, en particulier pendant la période néonatale (25% de décès dans une cohorte de 91 patients), tandis que la principale conséquence chez les survivants est une déficience cognitive. Des mutations bialléliques de TBX19 (T-Box Transcription Factor 19) ont été mis en évidence chez 65% de cas de patients avec antécédents de déficit corticotrope néonatal. TBX19 est impliqué dans la différenciation et la prolifération des cellules corticotropes et les mutations de TBX19 sont responsables de plus de 60 % des cas néonatals de déficit en ACTH. Le gène TBX19 code pour un facteur de transcription à boîte T présent dans les cellules hypophysaires exprimant POMC. TBX19 est nécessaire à la différenciation terminale de ces cellules et à l’expression du gène POMC. TBX19 est localisé sur le chromosome 1q24.2 et son transcrit principal est composé de 8 exons. Charnay et coll (Charnay T, Mougel G, Amouroux C, Gueorguieva I, Joubert F, Pertuit M, Reynaud R, Barlier A, Brue T, Saveanu A. A novel <i>TBX19</i> gene mutation in patients with isolated ACTH deficiency from distinct families with a common geographical origin. Front Endocrinol (Lausanne). 2023 Feb 15;13:1080649.) ont décrit une nouvelle variante du transcrit principal de TBX19, classée comme pathogène. Cette variante pathogène a été identifiée chez quatre patients issus de trois familles apparemment non apparentées. Deux de ces familles étaient consanguines et les trois familles avaient des racines dans la même région montagneuse du nord du Maroc, ce qui suggère un effet fondateur. Un diagnostic précoce, un traitement par hydrocortisone et une éducation préventive ont permis une croissance et une qualité de vie normales chez tous les patients. Parmi 17 cas de déficit non mutés TBX19, il a été mis en évidence 3 cas associés à un déficit immunitaire commun variable avec hypogammaglobulinémie, infections bactériennes récidivantes et dans 20% survenue de maladies auto-immunes. Ce déficit a été appelé DAVID syndrome (Deficit in Anterior pituitary function and Variable Immunideficiency) (28 cas depuis 2012). Ce syndrome est dû à des mutations hétérozygotes C-terminales de NFKB2. (NFKB2 – nuclear factor kappa B subunit 2) qui intervient dans le système immunitaire (voie alterne de la signalisation NKKB) (Mac TT, Castinetti F, Bar C, Julia S, Pasquet M, Romanet P, Saveanu A, Mougel G, Fauquier T, Jullien N, Barlier A, Reynaud R, Brue T. Deficient anterior pituitary with common variable immune deficiency (DAVID syndrome): a new case and literature reports. J Neuroendocrinol. 2023 Jun;35(6):e13287.) . Chez des souris porteuses de la même mutation, pas de déficit en ACTH observé mais déficit immunitaire. Afin de reproduire le développement hypophysaire humain et de préciser le rôle des mutations de TBX19 et de NFKB2, des cellules hypophysaires fonctionnelles ont été produites à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) ayant subi des modifications par CRISPR/Cas9 (Mac TT, Fauquier T, Jullien N, Romanet P, Etchevers H, Barlier A, Castinetti F, Brue T. Modeling corticotroph deficiency with pituitary organoids supports the functional role of NFKB2 in human pituitary differentiation. Elife. 2024 Nov 28;12:RP90875.). Le déficit corticotrope a été modélisé. L’introduction du variant pathogène homozygote TBX19K146R/K146R dans les hiPSC, un allèle trouvé dans le déficit corticotrope congénital isolé, a conduit à une forte réduction du nombre de corticotrophes dans les organoïdes hypophysaires. Ensuite, le développement d’organoïdes portant les mutations NFKB2D865G/D865G trouvées chez les patients atteints de DAVID syndrome a été modélisé. Il a été mis en évidence que la mutation p.K146R TBX19 altérait la différentiation corticotrope. Il a été conclu que NFKB2 jouait un rôle important dans le développement corticotrope.
Les perspectives ouvertes sont : identification des voies moléculaires affectées par NFKB2, utilité des organoïdes comme modèle d’étude des déficits hypophysaires et des mutations oncogéniques, des variants alléliques de signification incertaine, l’utilisation d’organe sur puce et peut-être la thérapie cellulaire.
Des cellules souches aux cellules sécrétrices d’insuline : quelles perspectives pour la compréhension et le traitement des diabètes ? par Raphaël SCHARFMANN (Institut Cochin, Paris)
Beaucoup d’efforts ont été faits en l’espace de 20 ans grâce notamment aux biologistes qui ont modélisé la biologie pancréatique. Raphaël Scharfmann a résumé 30 ans de travail dans le domaine. La génération de cellules bêta pancréatiques fonctionnelles à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) est l’un des principaux objectifs de la recherche sur les cellules souches, visant à fournir une source renouvelable et cohérente de cellules pour le traitement du diabète, en particulier le diabète de type 1 (DT1). Beaucoup d’équipes sont actuellement capables à partir de cellules embryonnaires multipotentes de produire des îlots matures insulino-secrétants (figure d’après Balboa). Un niveau élevé de fonctionnalité des cellules bêta est atteint in vitro, même si des différences métaboliques et transcriptomiques spécifiques existent entre les cellules ß des îlots SC et les cellules ß primaires (Balboa D, Barsby T, Lithovius V, Saarimäki-Vire J, Omar-Hmeadi M, Dyachok O, Montaser H, Lund PE, Yang M, Ibrahim H, Näätänen A, Chandra V, Vihinen H, Jokitalo E, Kvist J, Ustinov J, Nieminen AI, Kuuluvainen E, Hietakangas V, Katajisto P, Lau J, Carlsson PO, Barg S, Tengholm A, Otonkoski T. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 2022 Jul;40(7):1042-1055.).
L’application de ce type de technique est illustrée par de récentes études de phase 1 chez des patients diabétiques de type 1. Une équipe chinoise a rapporté en 2024 les résultats à un an d’un premier essai clinique de phase I chez l’Homme évaluant la faisabilité de la transplantation autologue, sous la gaine du rectus antérieur abdominal, d’îlots dérivés de cellules souches pluripotentes chimiquement induites (îlots CiPSC) pour le traitement du DT1. La patiente a pu être sevré de l’insuline à J75 après la transplantation avec normalisation de l’HbA1c (5 %). Après un an, les données cliniques ont satisfait à tous les critères d’évaluation de l’étude, sans mise en évidence d’anomalies liées à la transplantation..(Wang S, Du Y, Zhang B, Meng G, Liu Z, Liew SY, Liang R, Zhang Z, Cai X, Wu S, Gao W, Zhuang D, Zou J, Huang H, Wang M, Wang X, Wang X, Liang T, Liu T, Gu J, Liu N, Wei Y, Ding X, Pu Y, Zhan Y, Luo Y, Sun P, Xie S, Yang J, Weng Y, Zhou C, Wang Z, Wang S, Deng H, Shen Z. Transplantation of chemically induced pluripotent stem-cell-derived islets under abdominal anterior rectus sheath in a type 1 diabetes patient. Cell. 2024 Oct 31;187(22):6152-6164.e18.).
Le VX-880 est un traitement expérimental à base de cellules d’îlots de Langerhans entièrement différenciées, dérivées de cellules souches allogéniques produisant de l’insuline (entreprise Vertex®). Le VX-880 est en cours d’évaluation chez des patients atteints de DT1 avec hypoglycémies sévères récurrentes. Le VX-880 est administré par perfusion dans la veine porte et nécessite un traitement immunosuppresseur chronique pour protéger les cellules des îlots de Langerhans contre le rejet immunitaire. Avant le traitement par le VX-880, les six patients enrôlés souffraient d’un DT1 de longue date sans sécrétion endogène d’insuline, nécessitaient en moyenne 34 unités d’insuline par jour. Après 90 jours de suivi les patients avaient une production d’insuline endogène répondant au glucose lors du test de tolérance aux repas mixtes avec diminution de l’HbA1c et réduction ou arrêt de l’utilisation de l’insuline exogène (https://news.vrtx.com/news-releases/news-release-details/vertex-presents-positive-updated-vx-880-results-ongoing-phase-12).
Fort de l’expérience acquise antérieurement pas différentes équipes et la leur, en 2011, le groupe de R. Sharfmann a décrit un protocole d’oncogenèse ciblée dans le pancréas fœtal humain et produit la première lignée cellulaire β humaine fonctionnelle (EndoC-βH1), puis, les années suivantes, des lignées supplémentaires présentant des caractéristiques spécifiques. Ces lignées cellulaires sont actuellement utilisées par plus de 150 laboratoires universitaires et industriels dans le monde entier (Scharfmann R, Staels W, Albagli O. The supply chain of human pancreatic β cell lines. J Clin Invest. 2019 Sep 3;129(9):3511-3520.) (https://www.humanbetacelllines.com). Initialement, des fragments de pancréas fœtal humain (7-11 semaines de gestation) ont été transduits avec un vecteur lentiviral exprimant un promoteur de l’insuline (SV40LT). Ensuite, les fragments pancréatiques humains transduits ont été transplantés dans des souris immunodéficientes (SCID), qui constituent un environnement permissif pour la croissance et la différenciation des progéniteurs pancréatiques fœtaux humains. Dans le cas de la transduction d’un progéniteur de cellules β, cela a entraîné le développement d’un insulinome. Ensuite, les insulinomes ont été transduits avec un vecteur lentiviral exprimant hTERT et greffés à nouveau dans des souris SCID pour amplifier les cellulesβ proliférantes. Enfin, les insulinomes ont été prélevés chirurgicalement, dissociés en cellules individuelles et cultivés en tant que lignées cellulaires. L’une de ces lignées cellulaires a été caractérisée plus en détail et est devenue la première lignée cellulaire β humaine, EndoC-βH1. Les cellules EndoC-βH1 ressemblent aux cellules β humaines par leur expression de nombreux marqueurs génétiques et épigénétiques spécifiques, par l’expression limitée de marqueurs d’autres types de cellules pancréatiques et dans leur capacité à sécréter de l’insuline en réponse au glucose et à divers stimuli de l’insulino-sécrétion. La première génération de cellules EndoC-βH a été suivie d’une seconde puis d’une troisième génération (EndoC-βH2 et d’EndoC-βH3).
Le futur réside dans la capacité à produire de manière massive des cellules souches à partir de cellules ß (109-1011 cellules par patient (1-10g) soit pour 100 patients 1 kg de cellules. Il faudra rendre les cellules transplantées non immunes pour éviter els immunosuppresseurs chez les patients transplantés.
Les organoïdes thyroïdiens : quelles applications physiopathologiques et thérapeutiques ? par Sabine COSTAGLIOLA (Institut de recherche en Biologie Humaine et Moléculaire, Faculté de Médecine de l’Université Libre de Bruxelles)
La production d’hormones thyroïdiennes, en particulier la tri-iodothyronine (T3) et la thyroxine (T4), repose sur l’agencement des cellules folliculaires de la thyroïde en structures 3D monocouches appelées follicules, composés de cellules épithéliales polarisées. L’espace inter-folliculaire contient un groupe de cellules productrices de calcitonine (cellules C), ainsi qu’un vaste réseau de vaisseaux sanguins facilitant le transport des TH vers les tissus cibles. Le compartiment stromal de la glande thyroïde est principalement constitué de fibroblastes ecto-mésenchymateux. Des études de transplantation ont montré que les organoïdes thyroïdiens murins et humains conservent leur fonctionnalité lorsqu’ils sont transplantés dans la capsule rénale de souris.
Il n’a pas été mis en évidence de cellules souches dans la thyroïde adulte. Au sein du laboratoire, notre groupe de recherche a établi en 2012 un modèle 3D utilisant des cellules souches pluripotentes de souris pour induire l’expression transitoire des gènes Nkx2.1 et Pax8, facilitant la différenciation vers la thyroïde (Antonica F, Kasprzyk DF, Opitz R, et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 2012;491(7422): 66-71.). Un traitement par la TSH induisait la prolifération et la maturation. Après 22 jours, des follicules fonctionnels ont été observés in vitro et leur potentiel de restauration de la fonction thyroïdienne in vivo a été évalué en greffant des follicules 3D matures dans la capsule rénale de souris a-thyroïdiennes. Quatre semaines après la transplantation, les cellules dérivées des cellules souches ont généré des follicules produisant de la T4 entourés de vaisseaux sanguins. De plus, chez des souris a-thyroïdiennes les niveaux de T4 et de TSH se sont normalisés. Cette étude a démontré la capacité de la transplantation d’organoïdes thyroïdiens à restaurer la fonction thyroïdienne (Romitti M, Costagliola S. Progress Toward and Challenges Remaining for Thyroid Tissue Regeneration. Endocrinology. 2023 Aug 28;164(10):bqad136.).
En 2022, nous avons démontré que les cellules souches embryonnaires humaines peuvent se différencier en progéniteurs thyroïdiens par la surexpression transitoire de gènes clés (Romitti M, Tourneur A, De Faria Da Fonseca B, et al. Transplantable human thyroid organoids generated from embryonic stem cells to rescue hypothyroidism. Nat Commun. 2022;13(1): 7057.). Un pool de follicules thyroïdiens produits a été transplanté dans la capsule rénale de souris NOD-SCID a-thyroïdiennes. Les analyses effectuées 5 semaines après la transplantation ont révélé une augmentation des taux de T4 et de T3 accompagnée d’une réduction des taux de TSH. L’analyse histologique a montré l’accumulation de T4 dans la lumière de la plupart des follicules, entourés de vaisseaux sanguins dérivés de l’hôte. Des cellules stromales ont également été observées dans le compartiment inter-folliculaire, provenant du pool transplanté de cellules organoïdes.
Les applications actuelles par le groupe de Sabine Costagliola sont la modélisation et de nouvelles approches thérapeutiques de l’hypothyroïdie congénitale avec dysgénésie thyroïdienne, la modélisation du cancer de la thyroïde, de la résistance à la TSH, l’investigation des effets de perturbateurs endocriniens, et le développement de thyroïde sur puce (throid-on-chip).