primum movens de cette maladie spécifique à l’espèce humaine est un défaut de placentation, caractérisé par une invasion insuffisante du trophoblaste utérin, et notamment de la paroi des artères spiralées utérines. Dans cette étude, nous avons développé un modèle de culture des cellules trophoblastiques humaines impliquées dans l’implantation (cellules trophoblastiques extravilleuses) et testé in vitro leur propriété de cellules invasives. Nous révélons pour la première fois qu’un gène directement impliqué dans le développement placentaire, le PPAR γ est un acteur potentiel de la pathogénie de la prééclampsie. En effet, l’activation de ce récepteur nucléaire par des ligands naturels inhibe l’invasion de la cellule trophoblastique humaine. Or, les ligands naturels de ce récepteur semblent présents à l’interface fœto-maternelle.

INTRODUCTION

La prééclampsie est une complication majeure de la grossesse [1, 2]. Son diagnostic est clinique au deuxième trimestre de la grossesse ; il est caractérisé par l’association d’une hypertension artérielle et d’une protéinurie. Elle peut évoluer vers la crise d’éclampsie mettant en jeu le pronostic vital maternel et fœtal. Elle s’associe le plus souvent à un retard de croissance intra-utérin fœtal avec ses complications néonatales, pédiatriques, et métaboliques à l’âge adulte [3, 4]. La prééclampsie représente de fait un problème majeur de santé publique.

L’étiologie de la prééclampsie est d’origine placentaire puisque tous les signes cliniques de la maladie disparaissent dans l’heure qui suit la délivrance. Cependant sa pathogénie reste encore non élucidée. De multiples facteurs maternels génétiques ou environnementaux prédisposent à cette maladie : hypertension, diabète, augmentation de la résistance à l’insuline, race noire, primiparité… [2]. Récemment, une composante génétique maternelle et paternelle a été démontrée [5].

Le primum movens de cette maladie spécifique à l’espèce humaine est un défaut de placentation, caractérisé par une invasion insuffisante du trophoblaste au niveau utérin [6, 7]. La placentation humaine est en effet caractérisée par une invasion majeure du trophoblaste le conduisant au contact du sang maternel (placentation hémomonochoriale). Au cours des deux premiers trimestres de la grossesse, les cellules trophoblastiques au contact de la paroi utérine (appelées trophoblaste extravilleux) prolifèrent et envahissent la décidue puis le myomètre. Elles migrent dans la lumière des artères spiralées utérines où elles forment des bouchons trophoblastiques jusqu’à la douzième semaine de grossesse. Le trophoblaste extravilleux infiltre également la paroi des artères spiralées, détruit la couche musculaire lisse et la limitante élastique interne de ces artères. Les cellules trophoblastiques terminent leur migration dans la lumière des artères. Ce remaniement de la paroi artérielle en une tunique fibreuse atone, n’offrant plus de résistance au flux sanguin, conduit à une irrigation optimale de la chambre intervilleuse [8, 9]. Un défaut de perfusion de la chambre intervilleuse induit une hypoxie placentaire et peut déclencher les signes toxiques maternels sur un terrain prédisposé [2].

Le récepteur γ de l’activateur des peroxisomes (PPARγ) est un membre de la super famille des récepteurs nucléaires, modulateurs de la transcription de nombreux
gènes après liaison de leurs ligands spécifiques. Afin d’être actif et de se lier à l’ADN, le PPARγ se dimérise avec le récepteur X aux rétinoïdes (RXR) [10]. Le rôle du PPARγ a été largement démontré dans le développement du tissu adipeux [11], dans la régulation de l’homéostasie glucidique [12] et dans l’inhibition de l’expression de certains gènes pro-inflammatoires [13]. Par ailleurs, les études d’invalidation génique chez la souris ont révélé son rôle essentiel dans le développement placentaire et la différenciation trophoblastique [14].

Le PPARγ est activé par la liaison de ligands naturels (acides gras, composés oxydés des LDL et la prostaglandine J (15 Deoxy-PGJ ), mais aussi de synthèse tels les 2 2 thiazolidinediones utilisés dans le traitement du diabète de type 2 [10].

L’objectif de ce travail a été d’étudier le rôle du PPARγ et de ses ligands dans la modulation de l’invasion trophoblastique humaine. Nous avons ainsi révélé une très forte expression de ce gène dans la cellule trophoblastique humaine. Les ligands synthétiques mais aussi naturels de ce récepteur nucléaire inhibent l’invasion trophoblastique humaine.

MÉTHODOLOGIE

Échantillons placentaires et culture cellulaire

L’absence de modèle animal pour l’étude de la pathogénie de la prééclampsie, nous a conduit à mettre au point un modèle in vitro de culture de cellules trophoblastiques extravilleuses pour étudier leur capacité invasive [15]. Ces cellules sont isolées par digestion enzymatique contrôlée à partir de fragments placentaires du premier trimestre obtenus après interruption volontaire de grossesse. Mises en culture sur une matrice extracellulaire, elles digèrent celles-ci et leur potentialité invasive est testée en chambre bicamérale (chambre de Boyden).

Test d’invasion

Ce test est réalisé comme précédemment décrit [15]. Les cellules sont déposées dans une chambre bicamérale de Boyden, sur la face supérieure d’une membrane possé- dant des pores de diamètre 8 µm et recouverte de matrigel. Ces cellules envahissent le matrigel et émettent des pseudopodes à travers les pores. Les cellules invasives peuvent être visualisées et quantifiées par immunomarquage avec un anticorps spécifique anticytokératine 7. Les résultats du test d’invasion sont exprimés comme le nombre de pseudopodes émis par rapport au nombre de noyaux cellulaires sur la face supérieure du filtre. La moyenne des valeurs observées dans les puits (n = 3) contenant des cellules n’ayant subi aucun traitement est fixée à 1.

Quantification des transcrits spécifiques

L’expression des gènes dans les échantillons placentaires et les cultures cellulaires a été évaluée au niveau de l’ARN messager par PCR-quantitative en temps réel, comme précédemment décrit [16].

LDL natives et oxydées

Les LDL ont été isolées du plasma de sujets normolipidémiques, ne recevant aucun apport vitaminique ou traitement hypolipidémiant, par ultracentrifugation séquentielle et oxydées ou non par le Cu2+ selon la méthode précédemment décrite [17].

RÉSULTATS

Expression du PPAR γ dans la cellule trophoblastique humaine

En microscopie optique, la cellule trophoblastique extravilleuse invasive en culture apparaît comme une cellule épithéliale à gros noyau (Fig. 1, panneau A). La forte expression du PPARγ dans ces cellules est attestée en immunocytochimie par un marquage nucléaire spécifique (Fig. 1, panneau B) et les taux élevés de ses transcrits (Fig. 1, panneau C).

Mise en évidence in vitro de l’invasion trophoblastique

Comme il est illustré dans la Figure 2, cette cellule trophoblastique est invasive (panneau A). Cultivée in vitro sur une matrice (matrigel), dans un modèle en trois dimensions, elle traverse celle-ci, se déplace et envoie des pseudopodes à travers le filtre de la chambre bicamérale. Ces pseudopodes peuvent être visualisés à la face inférieure du filtre, en microscopie électronique à balayage (panneau B) ou par immunocytochimie avec un anticorps spécifique contre la cytokératine 7 (panneau C).

Effet des ligands naturels du PPAR γ sur l’invasion trophoblastique

Nous avons alors testé l’effet de ligands naturels du PPARγ sur cette invasion trophoblastique in vitro . Un traitement des cellules par la prostaglandine 15D-PGJ2 de 1 à 10 µmol/L induit une diminution dose dépendante de l’invasion cellulaire, maximale (50 %) pour 10 µmol/L. De la même façon, nous avons testé l’effet de LDL natives ou oxydées sur cette invasion trophoblastique in vitro . De façon très intéressante seules les LDL oxydées inhibent l’invasion trophoblastique de façon significative et maximale d’environ 50 % pour une concentration de 50 µg/ml.

Fig. 1. — Expression du PPARγ dans la cellule trophoblastique extravilleuse Panneau A : Aspect morphologique des trophoblastes extravilleux en culture en microscopie optique.

Panneau B : Marquage nucléaire spécifique du PPARγ en immunocytochimie. La coloration bleue des noyaux au DAPI permet de confirmer la localisation nucléaire.

Panneau C : Taux de transcrits du PPARγ dans des cellules trophoblastiques extravilleuses et des fibroblastes placentaires, évalué en PCR quantitative en temps réel par rapport à un gène de référence (PPIA ou cyclophilin A).

Fig. 2.— Modèle in vitro pour tester l’invasion trophoblastique.

Panneau A : Schéma d’une chambre bi-camérale de Boyden utilisée.

Panneau B : Observation en microscopie électronique à balayage de la face inférieure du filtre présentant des pores de 8 µm de diamètre et ayant laissé passer des pseudopodes des cellules trophoblastiques.

Panneau C : Observation en microscopie optique de la face inférieure du filtre. Les pseudopodes sont révélés avec un anticorps anti-cytokératine 7.

Fig. 3. — Effet de la prostaglandine 15D-PGJ (panneau A) et des LDL natives ou oxydées (panneau 2 B) sur la migration invasive des cellules trophoblastiques.

Les cellules sont cultivées 48 heures sur matrigel et l’invasion quantifiée comme décrit dans la méthodologie. Les cellules sont traitées ou non (contrôle) par les différents ligands du PPARγ. Les résultats représentent la moyenne plus ou moins la déviation standard de 3 déterminations lors d’une expérience représentative.

DISCUSSION

Les cellules trophoblastiques humaines au contact de la muqueuse utérine possè- dent des caractéristiques d’une cellule pseudotumorale : prolifération, invasion, migration. Cependant à l’inverse d’une invasion tumorale, l’invasion trophoblastique est précisément régulée. Elle est limitée dans le temps (premier trimestre de la grossesse) et dans l’espace (tiers supérieur du myomètre) et orientée spécifiquement vers la paroi artérielle. Elle offre donc un modèle unique en physiologie humaine d’une invasion cellulaire contrôlée et orientée. Les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’invasion trophoblastique sont encore mal connus et sont pourtant les acteurs principaux impliqués dans la pathogénie de la pré- éclampsie.

La potentialité invasive de la cellule trophoblastique semble être une caractéristique de cette cellule et non de son environnement puisqu’elle peut s’implanter de façon ectopique, notamment dans la trompe. Nous venons de montrer qu’elle possède dans ce site d’implantation les mêmes caractéristiques [18].

Dans ce travail, nous révélons pour la première fois qu’un gène directement impliqué dans le développement placentaire, le PPARγ, est un acteur potentiel de la pathogénie de la prééclampsie. En effet, l’activation de ce récepteur nucléaire par des ligands naturels inhibe l’invasion de la cellule trophoblastique. Or, les ligands naturels de ce récepteur semblent présents à l’interface fœto-maternelle. De fait, l’endomètre humain et la décidue produisent des prostaglandines [19]. Le tissu placentaire lui-même produit des prostaglandines et de nombreux lipides [20-22].

Dans cette étude, nous révélons par ailleurs que les LDL oxydées contenant des ligands connus du PPARγ, inhibent très fortement l’invasion trophoblastique. Les LDL oxydées sont des composants de la plaque d’athérome [23]. Une anomalie de la paroi des artères spiralées utérines de type athéromateuse est décrite dans la pré- éclampsie ; elle est potentiellement présente chez la femme diabétique ou obèse, terrain prédisposant à la prééclampsie [2]. Prééclampsie, athérosclérose et diabète sont en effet caractérisés par une dyslipidémie. Augmentation des triglycérides, diminution des HDL et augmentation des VLDL caractérisent ces pathologies. Ces dernières sont très facilement oxydables notamment dans l’espace sous-endothélial, où elles pénètrent facilement. Elles participent alors activement à l’inflammation et au stress oxydant, caractérisant la lésion d’athérome [23]. Nos données expérimentales suggèrent que le non remodelage de la paroi des artères spiralées utérines serait lié à une forte activation du PPARγ par des ligands présents anormalement dans cette paroi artérielle.

Nous venons par ailleurs de démontrer que le PPARγ est également exprimé dans le trophoblaste villeux et directement impliqué dans la régulation de la synthèse de l’hormone Chorionique Gonadotropique (hCG) [24].

Enfin, il faut souligner que le PPARγ se dimèrise exclusivement avec le récepteur RXR des rétinoïdes. Un effet synergique de leurs ligands est observé dans la modulation de la différenciation du trophoblaste humain [24-26].

En conclusion, cette étude ouvre pour la première fois une nouvelle voie de recherche dans le domaine de la prééclampsie. Elle oriente vers un rôle essentiel du PPARγ et de ses ligands dans le défaut d’invasion trophoblastique et donc de placentation, primum movens de la maladie.

REMERCIEMENTS

Les auteurs adressent leurs remerciements au Pr M. Vidaud et son équipe ainsi qu’à Mme Tricottet et au service de microscopie électronique de la Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques pour leur précieuse collaboration.

BIBLIOGRAPHIE [1] Walker J.J. — Pre-eclampsia.

Lancet , 2000, 356 , 1260-1265.

[2] Roberts J.M., Cooper D.W. — Pathogenesis and genetics of pre-eclampsia.

Lancet , 2001, 357 , 53-56.

[3] Barker D.J.P., Gluckman P.D., Godfrey K.M., Harding J.E., Owens J.A., Robinson J.S.

— Fetal nutrition and cardiovascular disease in adulte life. Lancet , 1993, 341 , 938-941.

[4] Evain-Brion D., Czerichow P. — Retard de croissance intra-utérin : approches physiopathologiques et thérapeutiques. Médecine Thérapeutique , 1996, 2 , 110-117.

[5] Esplin M.S., Fausett M.B., Fraser A., Kerber R., Mineau G., Carrillo J., Varner M.W.

— Paternal and maternal components of the predisposition to preeclampsia. N. Engl. J. Med ., 2001, 344 , 867-872.

[6] Zhou Y., Damsky C.H., Chiu K., Roberts J.M., Fisher S.J. — Preeclampsia is associated with abnormal expression of adhesion molecules by invasive cytotrophoblasts. J. Clin. Invest ., 1993, 91 , 950-960.

[7] Meekins J.W., Pijnenborg R., Hanssens M., McFadyen I.R., Van Asshe A. — A study of placental bed spiral arteries and trophoblast invasion in normal and severe pre-eclamptic pregnancies. Br. J. Obstet. Gynaecol ., 1994, 101 , 669-674.

[8] Redman C. — Cytotrophoblasts : Masters of disguise.

Nat. Med ., 1997, 3 , 610-611.

[9] Alsat E., Malassiné A., Tarrade A., Merviel P., Evain-Brion D. — Le cytotrophoblaste humain, un casse tête pour le biologiste. Med. Sci ., 1999, 15 , 1236-1243.

[10] Desvergne B., Wahli W. — Peroxisome proliferator-activated receptors : nuclear control of metabolism. Endocr. Rev. , 1999, 20 , 649-688.

[11] Rosen E.D., Sarraf P., Troy A.E., Bradwin G., Moore K., Milstone D.S., Spiegelman B.M., Mortensen R.M. — PPAR gamma is required for the differentiation of adipose tissue in vivo and in vitro . Mol. Cell , 1999, 4 , 611-617.

[12] Nolan J.J., Ludvik B., Beerdsen P., Joyce M., Olefsky J. — Improvement in glucose tolerance and insulin resistance in obese subjects treated with troglitazone. N. Engl. J. Med ., 1994, 331 , 1188-1193.

[13] Jiang C., Ting A.T., Seed B. — PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines. Nature , 1998, 391 , 82-86.

[14] Barak Y., Nelson M., Ong E., Jones Y., Ruiz-Lozano P., Chien K., Koder A., Evans R. — PParγ is required for placental, cardiac, and adipose tissue development. Mol. Cell , 1999, 4 , 585-595.

[15] Tarrade A., Lai Kuen R., Malassiné A., Tricottet V., Blain P., Vidaud M., Evain-Brion D. — Characterization of human villous and extravillous trophoblasts isolated from first trimester placenta. Lab. Invest ., 2001.

[16] Frendo J., Vidaud M., Guibourdenche J., Luton D., Muller F., Bellet D., Giovagrandi Y., Tarrade A., Porquet D., Blot P., Evain-Brion D. — Defect of villous cytotrophoblast differentiation into syncytiotrophoblast in Down’s syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. , 2000, 85 , 3700-3707.

[17] Therond P., Abella A., Denis L., Couturier M., Chalas J., Legrand A., Lindenbaum A. — In vitro study of the cytotoxicity of isolated oxidized lipid LDL fractions in human endothelial cells : relationship with the glutathione status and cell morphology. Free Radc. Biol. Med. , 2000, 28 , 585-596.

[18] Goffin F., Malassine A., Evain-Brion D., Merviel P., Cortez A., Frankenne F., Foidart J.M. — Trophoblastic differentiation along the invasive pathway does not depend on maternal environment : lesson from tubal pregnancy. Placenta , 2001, 22 , A25.

[19] Shaw K.J., Ng C., Kovacs B.W. — Cyclooxygenase gene expression in human endometrium and decidua. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids ., 1994, 50 , 239-243.

[20] Mitchell M.D., Kraemer D.L., Strickland D.M. — The human placenta : a major source of prostaglandin D2. Prostaglandins Leukot Med ., 1982, 8 , 383-387.

[21] Campbell F.M., Gordon M.J., Dutta-Roy A.K. — Placental membrane fatty acid-binding protein preferentially binds arachidonic and docosahexaenoic acids. Life Sci ., 1998, 63 , 235- 240.

[22] Malassine A., Besse C., Roche A., Alsat E., Rebourcet R., Mondon F., Cedard L. — Ultrastructural visualization of the internalization of low density lipoprotein by human placental cells. Histochemistry , 1987, 87 , 457-464.

[23] Bonnet J. — L’arthérosclérose.

Med. Sci. , 2001, 17 , 559-567.

[24] Tarrade A., Schoonjans K., Guibourdenche J., Bidart J., Vidaud M., Auwerx J., Rochette-Egly C., Evain-Brion D. — PPARγ / RXRφ heterodimers are involved in hCGβ synthesis and human trophoblast differentiation. Endocrinology , 2001, 142 .

[25] Tarrade A., Rochette-Egly C., Guibourdenche J., Evain-Brion D. — The expression of nuclear retinoid receptors in human implantation. Placenta , 2000, 21 , 703-710.

[26] Tarrade A., Schoonjans K., Pavan L., Auwerx J., Rochette-Egly C., Evain-Brion D., Fournier T. — PPARγ / RXRφ heterodimers control human trophoblast invasion. J. Clin.

Endocrinol. Metab. , 2001, 86 , 00-00.

DISCUSSION

M. Jacques CAEN

Est-ce que l’endothélium module l’invasion trophoblastique ? Y a t’il des antigènes communs entre l’endothélium et le trophoblaste ? Qu’en est-il de la cadhérine ?

Il est probable que les cellules endothéliales modulent l’invasion endovasculaire des trophoblastes. Des données in vitro préliminaires en co-culture nous révèlent en effet que la cellule endothéliale libère des facteurs solubles qui stimulent l’invasion trophoblastique. La cellule trophoblastique extravilleuse endovasculaire exprime à sa surface un grand nombre de marqueurs des cellules endothéliales, tels, à titre d’exemple, des molécules d’adhésion intercellulaire ou à la matrice spécifiques de l’endothélium (VCAM, PCAM, …).

M. Étienne-Emile BAULIEU

Que peut-on envisager comme ligands du PPAR γ à des fins préventives ou thérapeutiques, et quelle en serait la spécificité compte tenu de la distribution généralisée du récepteur ?

Les travaux présentés offrent une nouvelle voie dans la compréhension de la pathogénie de la prééclampsie. Ils sont encore trop préliminaires pour orienter vers un axe thérapeutique. Ils précisent cependant que la présence anormale de ligands pathogènes tels les LDL oxydées inhibe l’invasion trophoblastique soulignant l’importance d’un diagnostic précoce sur des terrains maternels prédisposés.

M. Jean-Daniel SRAER

L’éclampsie survient classiquement lors de la 1ère grossesse. Comment expliquer, dans votre hypothèse, que l’éclampsie ne se reproduise pas systématiquement lors des grossesses ultérieures ?

Il est en effet classiquement établi que la prééclampsie survient plus fréquemment lors d’une première grossesse. Cependant, des données épidémiologiques publiées en janvier 2002 dans le New England Journal of Medecine soulignent que, indépendamment de la primiparité, c’est l’intervalle de temps entre deux grossesses qui est le facteur prédisposant au développement de la prééclampsie.

M. Georges DAVID

On sait que, au cours de la grossesse, surviennent des emboles de cellules trophoblastiques dans la circulation maternelle. Quelle est leur origine ? Quel destin ont-elles ? Existe t-il des modèles animaux sur lesquels on puisse étudier les effets à long terme ? Des facteurs masculins, en liaison en particulier avec le sperme, peuvent-ils jouer un rôle dans le développement de l’éclampsie ?

Il est connu depuis longtemps que des cellules trophoblastiques sont présentes dans la circulation maternelle de nombreuses années après une première grossesse. Elles se nichent volontiers dans la petite circulation au niveau pulmonaire. Ces cellules n’ont jamais été caractérisées dans leur phénotype de trophoblaste villeux ou extravilleux. La placentation humaine est spécifique et aucun modèle animal ne permet d’aborder le devenir à long terme des trophoblastes humains circulants. Enfin, des études génétiques récentes ont mis en évidence l’existence de gènes d’origine paternelle prédisposant à la maladie.

M. Christian NEZELOF

Les cellules déciduales sont-elles totalement innocentes ?

Les cellules déciduales jouent un rôle certain dans la limitation de l’invasion trophoblastique en sécrétant notamment des facteurs solubles tels le TGFγ1 et des inhibiteurs de protéases. Cependant, il faut remarquer que l’invasion du trophoblaste est similaire en cas de grossesses ectopiques dans la trompe où il n’existe aucune décidualisation.

M. Raymond ARDAILLOU

Les substances attirant les trophoblastes dans la muqueuse utérine sont-elles identiques à celles responsables de la migration des leucocytes (Interleukine-8, RANTES, MCP-1…) ?

Ont-elles été identifiées ?

L’existence de modèle in vitro permettant de tester l’invasion trophoblastique est récente.

De fait les connaissances sur les facteurs solubles modulant la migration de ces cellules sont encore limitées. Cependant certains facteurs de croissance et certaines interleukines modulent celles-ci tels, à titre d’exemple, le TNFα et l’hépatocyte growth factor.

Bull. Acad. Natle Méd., 2002, 186, no 2, 409-419, séance du 26 février 2002