Parmi les grands problèmes de santé publique, les maladies génétiques ont une place à part dans la mesure où, pour l’instant, on ne conçoit pas qu’un traitement médicamenteux puisse corriger une anomalie génétique. Jusqu’à présent, l’essentiel des travaux a relevé de la thérapie-génique [1] et a consisté à corriger le défaut génétique dans l’ensemble de l’organisme ou seulement au niveau des organes particulièrement concernés, avec comme seule alternative dans certains cas : la greffe d’organes. Dans le cas de la mucoviscidose, ces stratégies ont été particulièrement étudiées car, chez l’homme, les cellules les plus atteintes étant les cellules épithéliales du système respiratoire, on pouvait envisager de les ‘‘ transfecter ’’ directement par voie aérienne afin d’éviter les difficultés et complications liées à une ‘‘ transfection ’’ par voie générale et touchant tout l’organisme. Après une première phase d’engouement, cette approche thérapeutique apparait comme encore loin d’avoir l’efficacité clinique escomptée. Face à ces résultats décevants, on peut s’interroger sur la pertinence d’une autre stratégie ne visant pas à corriger le défaut génétique mais à en corriger les effets dans la mesure où c’est la déficience de la ou des fonctions de la protéine codée par le gène muté qui est à l’origine de la maladie. Prenant en compte le grand nombre de gènes qui restent silencieux, une telle fonction ne pourrait-elle pas être assurée par l’activation de l’expression de protéines voisines et qui pourraient partager une fonction analogue ? C’est par exemple le cas des protéines exprimées pendant la vie fœtale, dont l’expression s’arrête à la naissance et que l’on peut considérer comme « mises en réserve ». D’autres sont aussi « en réserve » pour permettre à l’organisme de répondre à des conditions particulières, par exemple à des conditions de stress. C’est cette approche que nous avons explorée pour la mucoviscidose, partant d’une observation clinique inattendue.

LA MUCOVISCIDOSE

La mucoviscidose, aussi appelée la fibrose kystique (Cystic Fibrosis -CF- pour les anglo-saxons) est la plus fréquente des maladies héréditaires létales dans la population blanche dite caucasienne. L’incidence annuelle de la maladie est en France de 1/3000 naissances environ. Elle a pour origine la modification du gène cftr pour « cystic fibrosis transmembrane régulator », situé sur le chromosome 7 et codant pour la protéine CFTR, une protéine trans-membranaire de 1480 acides aminés.

Bien que près de 1000 mutations aient été identifiées, la mutation la plus fréquente (environ 75 % des cas) est nommée mutation ∆F508, correspondant à la délétion au niveau de la protéine d’un seul acide aminé, une phényle alanine, en position 508.

Mais d’autres parties codantes ou non du gène peuvent être le siège de mutations graves. La maladie n’affecte que les porteurs homozygotes.

La fonction de la protéine CFTR est universellement reconnue comme celle d’un canal trans-membranaire capable d’exporter les ions chlorures et est très largement
documentée. Le diagnostic précoce de la maladie est lié à cette fonction et consiste en la mesure de la quantité de sel contenu dans la sueur qui est deux fois supérieure à la normale.

La pathologie se manifeste chez l’homme essentiellement au niveau des poumons dont les voies aériennes sont obstruées progressivement par un mucus trop visqueux perturbant la fonction d’épuration ciliaire. On observe une inflammation des voies respiratoires dès la naissance puis plus tard la colonisation de celles-ci par des bactéries pathogènes comme Pseudomonas aeruginosa dont il est très difficile de se débarrasser et qui nécessitent des cures lourdes d’antibiothérapie en hospitalisation.

Le tableau clinique s’aggrave progressivement avec fibrose et destruction du tissu pulmonaire, conséquence de l’inflammation et de l’infection. Actuellement l’espé- rance de vie est de l’ordre de 25 à 30 ans.

D’autres organes sont également touchés plus ou moins gravement : le pancréas, le colon avec des cas d’occlusions intestinales, le système reproducteur chez l’homme avec obstruction ou absence des canaux déférents et le foie au niveau duquel on observe des cirrhoses ou des cancers. 20 % des jeunes adolescents développent aussi des polyarthrites rhumatoïdes.

Il n’existe pas de traitement efficace autre que la kinésithérapie permettant de dégager les voies respiratoires ou en phase terminale, la greffe de poumon ou foie-poumon avec un taux de réussite faible. Cependant certains sujets sont peu affectés par la maladie et ne développent que des troubles de type bronchites chroniques à partir de 40-50 ans. Les raisons possibles de cette apparente résistance ne sont pas connues et seront évoquées ultérieurement.

Toutes les mutations sont caractérisées par l’absence ou la non-fonctionnalité de CFTR au niveau de la partie apicale de la membrane de certaines cellules. Ceci peut être la conséquence de différents dysfonctionnements au niveau de la transcription, de la maturation, du transport au niveau de la membrane (c’est le cas pour la mutation ∆F508), ou de l’absence de fonction de la protéine.

CFTR appartient à la famille des transporteurs ABC (pour ATP Binding Cassette).

Les protéines ABC représentent la plus grande famille des transporteurs connue à ce jour [2] et ont une fonction commune qui est le transport d’une variété considérable de substrats en allant des ions aux macromolécules. Chez l’homme, les plus connues sont outre CFTR, les P-glycoprotéines (PgP), appelée aussi MDR, produit du gène mdr (Multidrug Resistance), et les MRP (Multidrug Resistance associated Proteins). Ces protéines sont largement impliquées dans les mécanismes de résistance médicamenteuse, bien connus en cancérologie où leur expression massive par les cellules cancéreuses est responsable de la récidive de cancers après traitement par chimiothérapie.

Actuellement quarante-neuf transporteurs de la famille ABC ont été identifiés chez l’homme [3] mais seulement une douzaine sont relativement bien connus. Il n’existe à ce jour aucune structure de l’un de ces transporteurs (humains) et le mécanisme de leur fonctionnement est également très discuté. Chez l’homme des mutations de
certains de ces transporteurs sont à l’origine d’autres maladies génétiques : cholestases hépatiques pour MDR3, maladie de Dubin-Johnson pour MRP2 ou la dégénérescence de la macula de la rétine pour ABCR (maladie de Stargardt). La structure du domaine NBD1 de hCFTR obtenue par diffraction des rayons X vient d’être publiée. Elle ne montre pas de modifications structurales importantes entre la forme sauvage et la forme mutée. Plusieurs structures de fragments ou transporteurs entiers bactériens sont maintenant disponibles [4-6]. CFTR est formé de deux sous-unités de même nature. Chacune comprend six domaines trans-membranaires et un domaine de liaison à l’ATP ou Nucléotide Binding Domain (NBD) (Figure 1) ;

Ces deux structures sont liées entre elles par un domaine cytoplasmique dit régulateur et appelé R, dont la phosphorylation intervient dans la modulation de la fonction de CFTR.

QUELQUES OBSERVATIONS SURPRENANTES

Observations fondamentales

La perte de la fonction canal chlorure attribuée à CFTR mutée est loin d’expliquer la globalité de la pathologie de la mucoviscidose. L’argumentation classique rendant compte de l’augmentation de la viscosité du mucus, repose sur le fait que CFTR n’exportant pas correctement le sel, il y a importation d’eau par compensation osmotique et donc dessèchement du mucus.

Par ailleurs, les mesures de transport d’ions chlorure par CFTR montrent que cette protéine est un canal chlorure de faible conductance régulé par l’AMP cyclique.

Récemment des études ont montré un rôle régulateur de CFTR pour d’autres canaux ioniques. Elle activerait des canaux appelé ORCC (Outwartly Rectifying Chloride Channel) qui sont des canaux chlorure de conductance plus élevée que CFTR (10 à 100 fois) et également les canaux chlorure calcium dépendant. Ceci provoquerait une sécrétion d’ions chlorures supplémentaire. Par ailleurs CFTR régulerait négativement l’activité du canal sodium appelé EnaC.

En plus d’une analogie de séquence élevée, il est admis qu’il existe une analogie de structure entre CFTR, MDR et MRP. La comparaison des profils d’expression des gènes mdr1 et cftr chez le rat [7] par hybridation in situ montre une régulation complémentaire de ces deux protéines ABC. Ceci suggère une analogie de mécanisme. D’autres données de la littérature suggèrent également une ressemblance fonctionnelle entre ces protéines [8]. L’acquisition progressive de la résistance aux médicaments de cellules épithéliales HT29, qui expriment naturellement CFTR, est associée à l’augmentation correspondante de MDR et à une diminution importante du niveau de CFTR exprimés confirmant une corrélation dans l’expression de ces deux protéines. De même une fonction de type « multidrug resistance » analogue à celle assurée par MDR1 peut être jouée par CFTR lorsqu’elle est surexprimée [9].

La forte ‘‘ ressemblance ’’ entre CFTR, les MDR’s et MRP’s nous a conduit à penser que CFTR pouvait jouer en plus de son rôle de transporteur et/ou de régulateur de transport des ions chlorures, un rôle de transporteur d’autres molé- cules chargées ou non. Nous avons évoqué mais sans le prouver un rôle possible des leukotriènes (LTC4) dont les actions ressemblent de façon surprenante aux phénotypes observés dans la mucoviscidose.

Observation clinique

En 1994, Gérard Lenoir avait fait une observation surprenante : celle de l’amélioration notable et durable de l’état d’un patient (∆F508-G673X) atteint de mucoviscidose, dont les problèmes pulmonaires avaient fortement régressé à la suite d’un traitement anti-tumoral. Se déclarant « guéri » de sa mucoviscidose, il avait arrêté tout traitement adjuvant. Sa trace fut perdue pendant trois ans, et il n’a été retrouvé que parce qu’il avait développé des métastases pulmonaires nécessitant une intervention réalisée à l’Hôpital Foch. Il fut alors constaté que son état pulmonaire était normal au niveau de l’inflammation et de la viscosité du mucus. Recontacté ensuite par l’hôpital Necker, ce patient présentait toujours un test de la sueur très positif.

L’explication que nous avons alors proposée [10] est celle d’une compensation fonctionnelle de CFTR mutée et inactive par une ou plusieurs autres protéines ABC induites par la chimiothérapie. De fait, le traitement par chimiothérapie avait provoqué chez ce malade la surproduction, toujours détectable après arrêt du traitement, des gènes cftr, mdr et mrp. La persistance d’un test de la sueur fortement positif prouvait par ailleurs que le CFTR était restée non fonctionnelle au niveau du transport des ions chlorures. Cependant, le caractère persistant de cette guérison reste inexpliqué. D’autres cas similaires de « guérison » de mucoviscidose lors d’une chimiothérapie ont été ensuite répertoriés, de même qu’une amélioration très sensible, conséquence d’un traitement sous-dosé et de longue durée par l’azithromycine.

[11] Nous avons alors proposé que ces traitements avaient induit, comme ceci est reconnu, une surproduction des protéines de résistance de type MRP et/ou MDR et que celles-ci s’étaient ‘‘ substituées ’’ sur le plan fonctionnel à CFTR déficient.

VERS UNE NOUVELLE STRATÉGIE THÉRAPEUTIQUE

Pour valider cette hypothèse, un essai de traitement de Phase II de la mucoviscidose par la colchicine a été lancé, en 2001, par l’équipe de Gérard Lenoir (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris). Plusieurs arguments militaient en faveur de cet antimitotique utilisé jusqu’à présent essentiellement dans la goutte : ses propriétés anti-inflammatoires par son action au niveau des polynucléaires, ses capacités connues d’être un bon inducteur de la sur-production de MDR, et surtout son autorisation d’administration à des enfants pour une autre maladie génétique : la fièvre méditerranéenne héréditaire avec un mécanisme d’action inconnu.

Un essai en ‘‘ double aveugle ’’, utilisant la N-acétyl-cystéine comme placébo, a été réalisé sur 68 enfants de plus de cinq ans atteints de formes moyennement sévères de la maladie. 61 patients terminèrent l’essai en suivant scrupuleusement le protocole.

Les résultats sont schématiquement rapportés sur la figure 2 qui représente l’évolution du volume en expiration forcée pendant une seconde : FEV1 en fonction du nombre de mois de traitement. Tous les sujets ayant reçu de la colchicine (31) ont été globalement améliorés (p = 0,02) avec cependant une forte dispersion ; quatre cas ont donné des résultats remarquables (figure 3). Enfin sur un cas, il a pu être montré qu’un rétablissement quasi normal d’un courant d’ions chlorure mesuré sur des cellules provenant d’un brossage nasal de patient après six mois de traitement était observé et que ce courant n’était pas sensible à l’action de l’AMP cyclique (figure 4).

Il ne pouvait donc pas être attribué à une restauration de la fonction de CFTR mais plutôt à une compensation fonctionnelle par des protéines voisines. Cette observation a été confirmée par Dragomir en 2004 sur une lignée cellulaire Calu3 cftr-/cftraprès incubation avec de la colchicine [12].

La dispersion forte des résultats laisse penser qu’ils dépendent de la variabilité du patrimoine génétique de chacun et de la capacité à induire des protéines de « secours » non exprimées sans traitement et capables de se substituer à CFTR dans sa ou ses fonctions. Ceci est à rapprocher de la découverte d’homozygotes de mutation graves de CFTR qui ne présentent pas les symptômes de la maladie. On peut penser que chez ces personnes le mécanisme de compensation que nous proposons, soit déjà spontanément activé.

CONCLUSION

D’une manière générale, et quelle que soit l’issue des premiers tests thérapeutiques, la molécule employée n’étant pas optimisée, une piste est ouverte : elle s’appuie sur la possibilité d’amplifier l’expression de transporteurs ABC voisins de CFTR capables de se substituer fonctionnellement à elle.

Une telle stratégie pourrait également s’appliquer à d’autres pathologies inflammatoires, comme certaines formes de polyarthrite rhumatoïde (dont un des traitements utilise le méthotréxate, un anticancéreux) ou l’asthme, qui sont plus fréquemment rencontrés chez certains porteurs hétérozygotes de la mucoviscidose.

Une voie générale de recherche sur les maladies génétiques pourrait donc être l’identification de mécanismes similaires et leur activation par des substances chimiques. Actuellement de nombreux essais cliniques similaires sont en cours un peu partout dans le monde avec l’azithromycine (inducteur de MDR), la gentamicine connue pour provoquer le saut de mutations stop lors de la transcription, des xanthines (CPX) et des banques entières sont criblées de façon aveugle.

Deux stratégies faisant appel à la réactivation des protéines fœtales sont actuellement à l’étude pour l’anémie falciforme et la myopathie de Duschenne. Enfin, un
article récent passé un peu inaperçu, rapporte que le rôle de CFTR serait majeur dans le développement embryonnaire et que c’est à cette période que s’installerait un ensemble de mécanismes responsables d’un réaction inflammatoire non contrôlée.

REMERCIEMENTS

Nous remercions la Société Transgène pour la fourniture gratuite d’anticorps et la Société Pierre Fabre pour son aide dans l’établissement du protocole de test avec la colchicine.

BIBLIOGRAPHIE [1] CAVAZZANA-COLVO M., HACIEN-BEY S., DE SAINT-BASILE G., GROSS F., FISCHER A. — Gene therapyof human severe combined immunodefiency (SCID)-X1 disease., Science , 2000, 288 , 669-672.

[2] ABC Proteins : From Bacteria to man, HOLLAND B., COLE S., KUCHLER K., HIGGINS C. — Academic Press, Elsevier edit., 2003.

[3] Voir par exemple :http : //nutrigene.4T.com/humanabc.htm.

[4] ROSENBERG F. et al . — J. Biol. Chem ., 2004, 279 , 39051.

[5] CHANG G., ROTH C.B. — Structure of MsbA from E. coli : a homolog of the multidrug resistance ATP binding cassette (ABC) transporters, Science , 2001, 293 , 1793.

[6] LEWIS H. et al . — Structure of nucleotide-binding domain 1 of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, —

EMBO J. , (2004) 23 , 282.

[7] TREZISE A.E., ROMANO P.R. et al . — The multidrug resistance and cystic fibrosis genes have complementary patterns of epithelial expression.

EMBO J., 11 (12) : 4291-303.

[8] BREUER W., SLOTKI I.N. et al . — Induction of multidrug resistance downregulates the expression of CFTR in colon epithelial cells.

Am. J. Physiol. , 1993, 265 , C1711-5.

[9] WEI L.Y., STUTTS M.J. et al. — Overexpression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in NIH 3T3 cells lowers membrane potential and intracellular pH and confers a multidrug resistance phenotype,. Biophys J., 1995, 69 , 883-95.

[10] LALLEMAND J.-Y., STOVEN V., ANNEREAU J.-P. et al. — Induction by antitumoral drugs of proteins that functionnally complement CFTR : a novel therapy for cystic fibrosis ?

The Lancet , 1997, 350, 711-712.

[11] JAFFE A., FRANCIS J., ROSENTHAL M., BUSH A. —

The Lancet , 1998, 351 , 1286-1287.

[12] DRAGOMIR A, ROOMANS G.M. — Increased chloride efflux in colchicine-resistant airway epithelial cell lines. Biochem. Pharmacol., 2004, 68 (2), 253-61.

DISCUSSION

M. Raymond ARDAILLOU

Comment peut-on expliquer qu’un traitement court par un inducteur de la synthèse des protéines ABC entraîne un effet de longue durée sur les signes cliniques de la mucoviscidose ?

Nous n’avons pas de réponse pour l’instant. Nous pensons que le traitement par des anticancéreux peut induire une modification durable de l’expression des protéines ABC, peut-être en touchant certaines cellules souches mais nos travaux sont beaucoup trop préliminaires pour le confirmer. Une autre possibilité serait la reconstitution d’un allèle intact par recombinaison chromosomique dans le cas de malades portant deux mutations différentes sur chaque allèle ce qui était le cas pour le malade de référence. On sait que certains anticancéreux favorisent ce processus.

M. Pierre GODEAU

Lors d’échecs de chimiothérapie liés au gène MDR, on avait proposé un traitement par inhibiteurs calciques supposés bloquer l’afflux en dehors de la cellule cancéreuse des drogues utilisées. Y a-t-il une intervention des canaux calciques dans les mécanismes que vous avez identifiés ?

Nous n’avons pas étudié la possible intervention des canaux calciques.

Bull. Acad. Natle Méd., 2005, 189, no 5, 789-796, séance du 10 mai 2005