À travers cette présentation, j’exposerai comment l’étude initiale du rôle du virus de l’hépatite B (HBV) dans le cancer du foie nous a conduite à nous intéresser aujourd’hui à l’organisation fonctionnelle du noyau et à son importance dans les pathologies humaines.

DU VIRUS DE L’HÉPATITE B AUX RÉCEPTEURS DE L’ACIDE RÉTINOI ı QUE

La première étape qui a permis d’établir un lien entre ces deux sujets apparemment très éloignés va nous conduire aux récepteurs de l’acide rétinoïque.

Ce sont des études épidémiologiques qui, les premières, permirent d’établir un lien direct entre l’infection chronique par l’HBV et le développement du cancer du foie [1]. Il existe, notamment, une corrélation géographique parfaite entre la prévalence du virus B et l’incidence des cancers du foie dans le monde. Ainsi, les régions de forte endémicité pour l’HBV, comme l’Asie du Sud-Est ou l’Afrique sub-saharienne où plus de 10 % de la population est chroniquement infectée, sont aussi les régions les plus touchées par le cancer du foie. A l’inverse, dans les régions de faible endémicité comme l’Europe ou l’Amérique du Nord, le cancer du foie reste un cancer rare.

Alors, comment l’infection par le virus B conduit-elle au développement d’un cancer du foie ?

Le virus possède la propriété de pouvoir intégrer son génome dans l’ADN de la cellule hôte infectée [2]. Un certain nombre de ces insertions virales ont été caractérisées après clonage moléculaire. Elles sont réparties un petit peu partout sur l’ensemble des chromosomes humains. Au vu de ces intégrations, on pouvait se demander si, à la manière de certains rétrovirus, l’ADN HBV pouvait, dans certains cas au moins, s’insérer au voisinage d’un oncogène cellulaire et en altérer ainsi l’expression. Pour tenter de répondre à cette question, nous avions entrepris l’étude d’un patient qui présentait une tumeur du foie avec une intégration virale unique.

L’étude précise du site d’insertion du virus HBV avait révélé la présence d’un gène présentant une forte homologie avec les récepteurs aux glucocorticoïdes, aux oestrogènes et à l’hormone thyroïdienne T3 [3]. En collaboration avec l’équipe de Pierre

Chambon, nous avons pu identifier le ligand de ce nouveau récepteur comme étant l’acide rétinoïque (AR), autrement dit la forme active de la vitamine A, un gradient de concentration d’AR, serait responsable de la formation de l’axe antéropostérieur [4]. Ainsi chez le patient d’origine, l’HBV s’était intégré dans le gène codant pour le récepteur de l’acide rétinoïque (RAR), alors appelé récepteur β, de façon à générer une protéine de fusion, une protéine hybride, entre la protéine d’enveloppe du virus B, appelée protéine pré-S1, et ce récepteur.

En conclusion, ces résultats, qui auront conduit à identifier de manière fortuite le premier récepteur à l’acide rétinoïque (depuis cinq autres ont été caractérisés), ont permis de montrer que l’HBV peut jouer le rôle de mutagène insertionnel et que, de cette façon, il pourrait être impliqué, dans certains cas au moins, directement dans la carcinogenèse hépatique. Cependant cela reste un phénomène très rare puisque seuls trois autres cas de mutagenèse insertionnelle due à l’HBV chez l’homme ont été rapportés, touchant à chaque fois un gène différent. Ces données fournissaient d’autre part la première indication qu’un récepteur à l’AR altéré puisse être impliqué dans l’oncogenèse chez l’homme.

Avant de poursuivre sur cette idée, j’aimerais survoler une dizaine d’années et rappeler très brièvement les principales propriétés de l’AR et de ses récepteurs. Les effets majeurs de l’AR sur la différenciation cellulaire ainsi qu’au cours du développement sont largement documentés [5]. En ce qui concerne le premier point, les modèles des cellules de tératocarcinome embryonnaire F9 et de la lignée leucémique HL 60 sont particulièrement intéressants. En effet, dans ces deux cas, l’AR induit une différenciation irréversible en cellules normales matures : endoderme pariétal dans le cas des cellules F9 et granulocytes dans le cas des cellules HL60. Ces observations ont pu être étendues à un certain nombre de cancers chez l’homme ;

cependant la régression de la tumeur induite par l’AR est malheureusement souvent partielle et réversible. Seul le cas de la leucémie aiguë à promyélocytes, sur laquelle je vais largement revenir, échappe à cette règle. L’AR est d’autre part largement utilisé en dermatologie, notamment pour son effet inhibiteur sur la synthèse des kératines et finalement, en ce qui concerne le développement, mis à part son pouvoir extrêmement tératogène décrit tant chez l’homme que chez l’animal, l’AR est à ce jour le seul morphogène qui ait été décrit chez les vertébrés. Ainsi un gradient de concentration d’AR serait responsable de la formation de l’axe antéropostérieur, au niveau du bourgeon embryonnaire des membres du poulet, modèle le mieux étudié jusqu’à présent.

Ces effets multiples de l’AR sont médiés par des récepteurs localisés dans le noyau qui sont au nombre de 6 : les RAR proprement dits, α, β et γ dont les ligands sont l’AR tout trans et 9 cis et les RXR α, β, γ qui eux ne lient que l’AR 9 cis [6]. Ces récepteurs, qui se lient à l’ADN et agissent comme des facteurs de transcription inductibles par un ligand, appartiennent à une grande famille multigénique dite famille des récepteurs nucléaires qui compte aussi les récepteurs aux hormones stéroïdes, à l’hormone thyroïdienne, à la vitamine D3, aux acides biliaires ainsi qu’un grand nombre de récepteurs orphelins dont les ligands restent à identifier.

DES RÉCEPTEURS DE L’ACIDE RÉTINOÏQUE À LA LEUCÉMIE AIGUË PROMYÉLOCYTAIRE

L’altération du gène du récepteur β de l’AR dans un cancer du foie nous avait incitée à rechercher des réarrangements dans les gènes RARs dans d’autres types de tumeurs chez l’homme. Et, en collaboration avec Laurent Degos à l’hôpital St Louis et Hugues de Thé au laboratoire, nous avons décidé de nous attacher au cas des leucémies aiguës à promyélocytes (LAP).

En effet ces leucémies, outre des caractéristiques cliniques propres, présentent dans plus de 95 % des cas une translocation spécifique entre les chromosomes 15 et 17 et surtout une sensibilité tout à fait particulière à l’AR in vitro et in vivo . En effet les équipes de Zen Wang à Shanghaï et de Laurent Degos à Paris ont montré que l’AR induit chez ces patients des rémissions complètes et cela en déterminant une différenciation des cellules leucémiques en granulocytes matures [7, 8]. Il s’agissait là du premier exemple de thérapie par différenciation et ces résultats, lorsqu’ils furent publiés, suscitèrent un certain nombre de réactions car il s’agissait d’un nouveau concept en thérapie anticancéreuse, il ne s’agissait plus de tuer, de détruire la cellule tumorale comme peuvent le faire les traitements classiques mais bien d’induire la différenciation cellulaire, de remettre la cellule sur le droit chemin. L’effet in vitro de l’AR sur ces cellules leucémiques LAP est tout à fait frappant. En effet, les blastes qui sont bloqués à un stade précoce de leur différenciation et présentent un gros noyau se différencient en polynucléaires neutrophiles caractérisés par l’apparition de noyaux polylobés après un traitement de 5 jours par l’AR.

Le gène RARα étant localisé en 17q21, donc proche du point de cassure cartographié par les cytogénéticiens et en raison de la sensibilité toute particulière à l’AR, nous nous sommes demandés si le gène RARα pouvait être impliqué dans ce type d’hémopathie.

L’étude des cellules leucémiques de ces patients LAP nous a effectivement permis, parallèlement à deux autres équipes dans le monde, de mettre en évidence l’existence d’une fusion résultant de la translocation 15 ; 17 entre un nouveau gène alors baptisé PML pour ProMyéLocyte, localisé sur le chromosome 15 et le gène RARα sur le chromosome 17 [9-11]. Deux types de protéines chimériques PML-RARα résultent de cette fusion, une version longue (rencontrée chez environ la moitié des patients) et une version plus courte, observée chez l’autre moitié, qui diffère par un point de cassure situé un petit peu plus en amont au sein du gène PML.

Comment se comporte l’hybride PML-RARα par rapport au récepteur RARα natif en ce qui concerne ses propriétés d’activateur de la transcription ? Lorsque l’on exprime, dans des cellules eucaryotes, le récepteur RARα natif avec un gène indicateur placé sous le contrôle d’un promoteur sensible à l’AR, on observe comme attendu une forte induction de la transcription en réponse à l’AR. Lorsque maintenant on exprime l’hybride PML-RARα sous sa forme longue ou courte, on observe
que cet hybride a perdu ses propriétés transactionnelles et qu’il est même capable d’entrer en compétition avec les récepteurs à l’AR endogènes pour bloquer la réponse à l’AR. Donc, dans ces conditions, PML-RARα apparaît comme un répresseur de la transcription et on peut ainsi imaginer qu’il puisse bloquer l’expression des gènes cibles de l’AR normalement impliqués dans la différenciation myé- loïde [pour revue, voir 12].

Récemment, trois autres types de translocations chromosomiques variantes ont été décrits dans moins de 2 % des cas de LAP [13]. Elles affectent systématiquement le gène du récepteur α de l’AR sur le chromosome 17 qui se trouve alors juxtaposé à des gènes différents. La plus fréquente des trois, la translocation [17], affecte une protéine à doigts de zinc de type Krüppel, appelée PLZF, la translocation (5 ; 17) affecte elle une protéine nucléolaire, la nucléophosmine et pour finir, un autre type de translocation (11 ; 17) altère la protéine nucléaire NuMA de l’appareil mitotique.

Ces quatre partenaires PML, PLZF, NPM et NuMA du récepteur α de l’AR ne présentent aucune homologie structurale ; cependant il s’agit dans tous les cas de protéines nucléaires qui possèdent de plus la propriété de s’autoagréger. Une caractéristique tout à fait particulière des leucémies associées à cette translocation variante 11 ; 17 est leur résistance totale au traitement par l’AR.

DE LA LEUCÉMIE AIGUE ı

PROMYÉLOCYTAIRE AUX CORPS NUCLÉ-

AIRES PML

J’aimerais, dans cette dernière partie, faire un bref rappel des résultats qui nous ont conduite à suspecter que l’effet thérapeutique de l’AR observé chez les patients souffrant de LAP pourrait être directement corrélé à sa capacité de restaurer une organisation subnucléaire normale.

Pour tenter d’élucider la fonction de la protéine PML native, nous avions dans un premier temps étudié sa localisation intracellulaire. Et les images d’immunofluorescence avaient alors révélé un profil inhabituel caractérisé par la présence d’un petit nombre de ponctuations dans le noyau, indiquant que la protéine PML endogène se concentre dans des structures subnucléaires particulières que nous avons alors appelées corps nucléaires PML. Des expériences de co-localisation, réalisées en collaboration avec Angus Lamond à l’EMBL, nous ont permis d’exclure que ces structures PML puissent correspondre à des sites actifs de transcription, de réplication ou d’épissage.

En microscopie électronique, ces corps nucléaires apparaissent comme des petites structures denses aux électrons dont le diamètre oscille entre 0.3 et 0.5 µm selon le type cellulaire étudié et qui présentent très souvent une organisation en anneau. La protéine PML est donc concentrée au niveau des ces corps nucléaires, en revanche, les récepteurs de l’AR sont, comme la plupart des facteurs de transcription, répartis de façon plus au moins homogène au sein du noyau. Que se passe-t-il maintenant dans les cellules leucémiques LAP ? Dans ces cellules, la chimère PML-RARα
entraîne une désorganisation massive des corps nucléaires PML qui apparaissent alors sous la forme d’une multitude de microstructures aberrantes.

De façon frappante, cette désorganisation des corps nucléaires est parfaitement réversible sous l’effet de l’acide rétinoïque. La visualisation de ce phénomène au niveau du noyau des cellules leucémiques est spectaculaire. En effet après 4 jours de traitement par l’AR, on observe une disparition de ces microstructures anormales qui s’accompagne de la restauration complète de corps nucléaires intacts. La réorganisation du noyau induite par l’AR offre un parallèle frappant avec son effet thérapeutique dans cette leucémie et pose la question importante de la fonction de ces corps nucléaires PML dans la cellule [14, 15].

Bien que l’on soit encore très loin d’avoir élucidé cette question, un certain nombre de données sont d’ores et déjà connues [pour revue, voir 16]. On sait qu’elles correspondent à un nouveau type de complexe multiprotéïque pour lequel deux composants ont été caractérisés : PML, ainsi qu’une autre protéine appelée SP100.

Nous avons vu que ces structures sont désagrégées de manière réversible par l’AR dans les cellules leucémiques promyélocytaires. Ces structures sont aussi extrêmement sensibles à différents stimuli externes tels que le choc thermique qui les pulvérise littéralement ou encore l’interféron qui, au contraire, stimule directement l’expression des deux protéines, ce qui se traduit par une augmentation de volume importante de la structure. Enfin l’infection par un certain nombre de virus à ADN, au contraire, désorganise à des degrés divers ces structures. La question subsiste de savoir si les corps PML correspondent à des sites actifs assurant une fonction bien spécifique du noyau ou s’ils correspondent à des sortes de réservoirs pour des facteurs cellulaires éventuellement recrutés lors de la réplication virale.

En conclusion, l’ensemble de ces travaux a conduit à isoler deux types de mutants naturels des récepteurs de l’AR associés à des tumeurs chez l’homme. D’une part une protéine hybride entre la protéine d’enveloppe de l’HBV et le récepteur RARβ dans un cas d’hépatocarcinome, d’autre part une protéine hybride entre le produit du gène PML et le récepteur RARα dans la majorité des leucémies aiguës promyélocytaires. Nous poursuivons actuellement nos recherches sur ces deux grands axes : le cancer du foie d’une part avec la recherche de gènes suppresseurs de tumeur et la leucémie promyélocytaire d’autre part, nous cherchons notamment à essayer de comprendre le mécanisme d’action de PML-RARα, et, dans ce contexte, à tenter d’élucider de façon plus générale la fonction des corps nucléaires PML au sein du noyau et le rôle de l’acide rétinoïque dans la différenciation hématopoïétique.

REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier Pierre Tiollais pour son soutien et toute l’équipe de l’Unité de Recombinaison et Expression Génétique à l’Institut Pasteur sans qui ce travail n’aurait pas été possible.

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Bull. Acad. Natle Méd., 2002, 186, no 4, 751-757, séance du 9 avril 2002