Résumé
La découverte de précurseurs circulants des cellules endothéliales (PEC) dans le sang périphérique chez l’homme adulte a ouvert de nombreuses perspectives en biologie vasculaire. De nombreux travaux sont venus confirmer l’existence des PEC, leur origine médullaire et leur aptitude à s’intégrer dans des structures vasculaires dans des sites de néoangiogenèse. Ils suggèrent que les PEC soient naturellement impliqués dans la prévention de l’ischémie en participant directement au processus de vascularisation. Par leur tropisme pour les sites de néoangiogenèse, les PEC constituent un outil thérapeutique potentiel pour le traitement des maladies ischémiques. Associés à d’autres cellules thérapeutiques, ils pourraient améliorer la régénération tissulaire en favorisant la vascularisation du greffon. Cependant l’utilisation des PEC en thérapie cellulaire est limitée par la rareté de ces cellules dans le sang périphérique. Le sang de cordon contient beaucoup plus de PEC, ces cellules sont fonctionnelles, et elles peuvent être amplifiées en culture. Leur utilisation clinique devra passer par des normes de production agréées et par une validation pré-clinique rigoureuse. Une autre utilité des PEC est qu’ils pourraient servir de contrôle de la qualité des unités de sang de cordon congelées, représentant un indicateur de la présence de cellules souches non hématopoïétiques dans ces unités. Ces contrôles de qualité sont importants dans le contexte où le sang de cordon est présenté comme une source prometteuse de cellules souches destinées à la réparation de tissus endommagés.
Summary
The discovery of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) in adult peripheral blood has opened up many exciting possibilities in vascular biology. Several studies have confirmed the existence of EPCs, as well as their bone marrow origin and their ability to integrate into vascular structures at sites of neoangiogenesis. EPCs appear to be naturally involved in the prevention of ischemia by participating directly in the vascularization process. Given their tropism for sites of neoangiogenesis, EPCs have clear therapeutic potential for treating ischemic diseases. If associated with other cell therapy products, they could improve tissue regeneration by promoting graft vascularization. However, the use of EPCs as a cell therapy product is limited by their rarity in peripheral blood. Cord blood contains many more EPCs, which are functional and can be expanded in culture. Their clinical use will require expansion in strictly controlled conditions and rigorous validation in preclinical models. EPCs could also serve as a quality marker for frozen cord blood, showing the presence of non hematopoietic stem cells.
Origine des progéniteurs endothéliaux circulants
Ces progéniteurs circulants ont été découverts en 1997 par l’équipe de Asahara [1].
Ils sont produits dans la moelle osseuse [2, 3] à partir de cellules souches qui n’ont pas encore été identifiées. Une cellule souche candidate est l’hémangioblaste, cellule capable de générer à la fois les cellules hématopoïétiques et endothéliales. L’existence des hémangioblastes a été décrite chez l’embryon [4], mais quelques publications indiquent que ces cellules souches pourraient être présentes dans la moelle osseuse adulte [5]. Les PEC passent naturellement de la moelle osseuse vers le sang périphérique par un processus appelé mobilisation, semblable à celui utilisé par les progéniteurs des cellules sanguines. Un certain nombre de facteurs de croissance, cytokines et molécules pharmacologiques induisent cette mobilisation des PEC [6].
Une fois dans le sang, ces cellules circulantes peuvent s’intégrer à distance dans des structures vasculaires qui doivent être réparées (néoangiogenèse). C’est probablement le rôle physiologique des PEC, qui assurent ainsi l’intégrité du système vasculaire [7]. Le nombre de PEC et leurs capacités de migration sont inversement corrélés aux facteurs de risque cardiovasculaires [8]. Le nombre de PEC augmente avec l’exercice physique [9] et il diminue avec l’âge [10]. Le nombre de PEC augmente significativement dans le cancer [11]. Ces données montrent que les PEC représentent un marqueur utile de réactivité du système vasculaire.
Comme c’est le cas pour les progéniteurs hématopoïétique, le sang de cordon est nettement plus riche en PEC que le sang périphérique (environ dix fois plus) [12], ce qui le rend particulièrement intéressant comme source de cellules thérapeutiques pour les maladies cardio-vasculaires.
Identification
Le problème de l’indentification des PEC par cytométrie en flux, est que ces cellules sont rares, (environ une pour cent mille cellules mononuclées dans le sang périphé- rique) et elles n’expriment pas de marqueurs spécifiques qui permettent de les identifier. Par ailleurs, d’autres cellules circulantes ont un phénotype proche de celui des PEC, comme c’est le cas pour les cellules endothéliales qui se détachent la paroi des vaisseaux. Il faut donc utiliser des combinaisons de marqueurs, mais les diffé- rents laboratoires qui étudient ces cellules n’utilisent pas les mêmes. Cela rend les études difficilement comparables entre elles.
Dans notre laboratoire, pour dénombrer les PEC, nous éliminons d’abord l’ensemble des cellules mononucléées matures (cellules dites Lin+). Cette déplétion élimine plus de 95 % des cellules. Sur les cellules Lin-, nous analysons celles qui expriment le récepteur 2 du VEGF (KDR), un marqueur des cellules endothéliales, le CD34, marqueur commun des cellules endothéliales et des progéniteurs hématopoïétiques, et le CD133, un marqueur exprimé sur de nombreuses cellules souches. Il est également important de bien éliminer les cellules mortes de l’analyse (par exemple cellules 7AAD-), car celles-ci faussent les résultats. En résumé, pour identifier les PEC du sang périphérique ou du sang de cordon, nous analysons les cellules qui ont le phénotype suivant : Lin-/KDR+/CD133+/CD34+/7AAD- [13].
Une autre façon de caractériser les PEC, est de les mettre en culture. Ces cellules adhérentes à des matrices (de type collagène I ou fibronectine), ce qui permet aux progéniteurs endothéliaux d’adhérer et de former des colonies [14]. Les cellules hématopoïétiques, non adhérentes, sont éliminées par des lavages successifs. La formation de colonies confirme bien le caractère immature des PEC. Ces colonies sont capables de donner des colonies secondaires et tertiaires. Le nombre de colonies obtenues à partir des PEC et leurs capacités à générer des colonies varie selon des paramètres physiologiques et pathologiques [12]. Elles diminuent avec l’âge, chez les fumeurs, les diabétiques, les patients atteints d’artérite. Elles augmentent chez les sportifs, chez les patients atteints de cancers.
Nous trouvons une corrélation entre les cellules ayant le phénotype décrit ci-dessus, mesuré par cytométrie en flux, et le nombre de colonies révélé en culture [13]. Le sang de cordon donne en moyenne dix fois plus de colonies dérivées des PEC que le sang périphérique adulte.
Les PEC, un outil permettant de contrôler la qualité des unités de sang de cordon congelées
Grâce aux travaux pionniers d’Eliane Gluckman, le sang de cordon a montré depuis vingt ans son utilité pour soigner un grand nombre de maladies hématologiques [15, 16]. Dans leur immense majorité, les unités de sang de cordon ont été utilisées pour des greffes allogéniques.
De nombreuses sociétés privées incitent les parents à conserver de façon payante le sang de cordon de leur enfant. L’argument utilisé est que les cellules souches qu’il contient pourraient être utilisées à des fins thérapeutiques, et grâce aux progrès de la recherche, pouvoir régénérer des organes ou tissus défectueux. Ces arguments reposent sur des travaux préliminaires qui indiquent que le sang de cordon contient des cellules souches capables de se différencier en cellules de différents types :
hépatique, pancréatique, neural, musculaire [17, 18]. Ces études utilisent des conditions inductives puissantes, qui révèlent ces potentiels, mais les cellules différenciées obtenues peuvent-elles constituer des produits de thérapie cellulaire ? A l’heure actuelle, les seules applications ayant montré leur efficacité clinique sont les pathologies hématopoïétiques. Les autres applications sont des paris incertains sur l’avenir, pas toujours présentéess comme telles auprès des « clientes ».
D’autres problèmes sont rarement abordés dans le cadre des banques autologues : la qualité du prélèvement (volume, pourcentage de cellules CD34+), et, surtout, le contrôle rigoureux des étapes allant du recueil du sang de cordon à sa décongélation. En ce qui concerne les PEC, et c’est aussi probablement le cas de toutes les cellules souches, nous avons constaté que leur nombre diminuait régulièrement en fonction du temps après le prélèvement. Au bout de 24 heures, plus aucune colonie dérivée des PEC n’est détectée.
En utilisant des échantillons de sang de cordon conservés dans la banque de l’hôpital Saint Louis à Paris, nous avons comparé la capacité des unités de sang de cordon fraîchement prélevées ou congelées à générer des colonies dérivées de PEC en culture. Environ un sang de cordon décongelé sur deux était capable de générer des colonies en culture (n=20), alors que presque tous les sangs de cordon frais généraient des colonies. Le nombre de colonies obtenues était trois fois inférieur avec le sang de cordon congelé qu’avec le sang de cordon frais. Cependant, les cellules endothéliales générées à partir des colonies provenant des deux sources avaient des propriétés phénotypiques et fonctionnelles comparables.
Cette étude montre que même lorsque les unités de sang de cordon sont prélevées, congelées puis décongelées dans des conditions rigoureuses, le nombre de PEC contenu dans ces unités diminue significativement. Il est probable que ce problème se rencontre avec d’autres types cellules souches contenues dans le sang de cordon.
L’utilisation du sang de cordon pour guérir des maladies non hématopoïétiques dépend bien sûr de la présence des cellules souches correspondantes après la décongélation des unités cryopréservées. La présence de ces cellules souches dépend de nombreux facteurs : volume du prélèvement, rapidité de la prise en charge du processus de congélation, conditions de la cryopreservation et de la décongélation.
La mesure du nombre de colonies dérivées des PEC dans ces unités, technique bien maitrisée, apporterait une information importante sur la qualité des unités de sang de cordon congelées, et donc de la banque dont ils proviennent.
Utilisation potentielle des PEC pour la thérapie cellulaire des maladies ischémiques
Nous avons caractérisé les propriétés des PEC isolés à partir du sang de cordon [14], et montré que ces cellules avaient les caractéristiques phénotypiques classiques des cellules endothéliales, mais qu’elles avaient des propriétés fonctionnelles particuliè- res : forte capacité de prolifération, réactivité importante aux facteurs de croissance angiogéniques. Ces propriétés associées au tropisme des PEC pour les sites d’angiogenèse permettent d’envisager leur utilisation en thérapie cellulaire, par exemple dans des pathologies ischémiques. L’efficacité de cette approche a été démontrée chez l’animal par de nombreuses études précliniques [19]. Il est aussi envisagé d’utiliser ces cellules en association avec d’autres types de cellules souches : cardiomyocytes ou cellules de muscle lisse pour la régénération cardiaque, ostéoblastes pour la régénération osseuse [20, 21].
Dans le cadre d’un projet associant plusieurs laboratoires publiques et sociétés de biotechnologies (projet Eurocord Lab), nous travaillons sur la production de PEC destinées à la thérapie cellulaire. Cette production implique une expansion des cellules dans des systèmes de culture clos, dans un milieu dépourvu de protéines animales. Nous avons mis au point un système d’expansion des PEC qui passe par la génération de colonies secondaires, qui permet d’obtenir plus de 109 cellules endothéliales après quelques passages. Cette quantité de cellules est compatible avec ce qui est nécessaire pour un produit de thérapie cellulaire.
Cependant, l’utilisation des PEC de sang de cordon comme produit de thérapie cellulaire est envisagé en condition allogénique, ce qui nécessitera le recours à des banques de PEC congelées, répertoriées du point de vue de leur typage immunologique. Ces cellules amplifiées congelées seront rapidement disponibles (quelques jours après décongélation) pour soigner les patients.
L’efficacité du sang de cordon a été démontrée dans les maladies où on doit reconstituer le système hématopoïétique. Les PEC du sang de cordon sont bien caractérisés par de nombreuses équipes et leur expansion en culture est facilitée par leur grande capacité de prolifération. Grâce à leurs propriétés, les cellules constitueront probablement le premier produit de thérapie cellulaire non hématopoïétique qui pourra être préparé à partir du sang de cordon BIBLIOGRAPHIE [1] Asahara T., Murohara A., Sullivan M., Silver R., Van Der Zee T., Li B., Witzenbichler G., Schatteman and J.M. — ISNER Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis, Science , 1997, 275 , 964-967.
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DISCUSSION
M. Jean CIVATTE
Les progéniteurs endothéliaux circulants peuvent-ils être impliqués dans le développement des tumeurs vasculaires bénignes ou malignes, congénitales ou acquises ?
Sur les PEC endogènes, les résultats sont contradictoires. Une étude, réalisée chez des patients qui avaient reçu une greffe de moelle de sexe opposé, et qui, plus tard, pour une raison indépendante ont développé des tumeurs, il a été montré que parmi les cellules endothéliales participant à la néo-angiogenèse tumorale, les cellules provenant du donneur étaient minoritaires (environ 5 %). Cependant cette étude était réalisée sur un nombre limité de cas. Chez la souris, nous avons montré que les cellules endothéliales dérivées des PEC augmentaient la taille des tumeurs de façon significative uniquement si elles étaient injectées en même temps et au même site que les cellules tumorales. Injectées par voie intraveineuse, elles ne produisaient pas d’effet mesurable sur la croissance tumorale. Il semblerait donc que les PEC n’aient pas un effet majeur sur la croissance tumorale, mais il est possible que cela puisse dépendre du type de tumeurs. Il serait prudent cependant de ne pas traiter les patients à risque par ce type de cellules.
M. Jacques MILLIEZ
Comment les maternités peuvent-elles collecter le sang de cordon ombilical ? A-t-on confirmé la surmortalité initiale chez des sujets greffés avec des cellules de sang de cordon ?
Pour pouvoir collecter le sang de cordon, la maternité doit avoir une convention avec une structure accréditée, qui gère l’analyse virale/bactérienne du prélèvement, qui fasse le typage HLA, et qui assure le processus de cryopréservation dans des conditions sécurisées. En France, ces structures appartiennent soit à l’EFS, soit à l’hôpital public. La constitution de banques privées n’est pas autorisée en France. A ma connaissance, ce n’est pas évident qu’il y ait surmortalité chez les patients greffés par du sang de cordon par rapport à une greffe de moelle. A la différence des greffes de moelle, qui sont HLA identiques, parce qu’elles sont mieux immuno-tolérées, les greffes de sang de cordon sont souvent non-HLA identiques (1 voir 2 mismatchs). Ceci peut augmenter le risque de GVH, mais les études ne montrent pas de surmortalité significative à long terme.
Comparées aux greffes de moelle osseuse, les greffes sang de cordon conduisent à une prise plus lente des neutrophiles et des plaquettes. Le facteur limitant est la dose de cellules. Chez l’adulte, la tendance est à la greffe de deux unités de sang de cordon.
M. Jean-François STOLTZ
Quelle est la stabilité des lignées au cours des passages nécessaires pour obtenir des quantités de cellules suffisantes pour un traitement (phénotypes, télomères, …) ?
Les cellules endothéliales dérivées des PEC sont assez stables. Par rapport aux cellules de vaisseaux sanguins, les marqueurs de sénescence apparaissent plus tardivement. La télomérase est stable elle aussi. Cependant, des études ont montré qu’en culture, il pouvait apparaître des anomalies caryotypiques. Il est crucial de contrôler cet aspect avant toute application thérapeutique.
Bull. Acad. Natle Méd., 2009, 193, no 3, 537-544, séance du 3 mars 2009
