Communication scientifique
Session of 3 avril 2007

Les nouvelles méthodes en recherche phamarceutique : chimie combinatoire et criblage à haut débit

MOTS-CLÉS : automatisation. chimie pharmaceutique/ méthodes. industrie pharmaceutique/tendances. miniaturisation.. techniques chimie combinatoire
New methods in pharmaceutical research : combinatorial chemistry and high throughput screening
KEY-WORDS : automation. chemistry, pharmaceutical/ methods. combinatorial chemistry techniques. drug industry/trends. miniaturization.

Daniel Schirlin, Martin Galvan, Gérard Le Fur

Résumé

L’intégration en recherche pharmaceutique, de nouvelles méthodes d’identification de composés tête de séries telles que criblage à haut débit et chimie combinatoire s’est traduite, dans les cinq-dix dernières années, par leur utilisation plus rationnelle, en une probabilité de succès accrue en sélection de candidats précliniques potentiels pour des cibles réputées difficiles.

Summary

New lead-identification methodologies such as high-throughput screening and combinatorial chemistry have been integrated into pharmaceutical research over the past 5-10 years. More rational use in the selection of potential preclinical candidates for some difficult targets has increased the chances of success.

Introduction.

Au cours des vingt dernières années, face à des pressions économiques et financières croissantes et en réponse au manque apparent d’innovation et de productivité, la
recherche pharmaceutique a adopté des méthodes de découvertes de principes actifs supposées plus efficaces [1].

Historiquement, l’activité biologique conduisant à la sélection de produits nouveaux était révélée directement in vivo [2]. Jusque vers le milieu des années 70, les essais de nouveaux composés étaient effectués sur des animaux entiers, individuellement, avec une capacité à évaluer environ trois composés par jour et par personne.

Les molécules, analogues proches, étaient synthétisées en quantité relativement importante sur la base de chimies originales de type hétérocyclique ou autre [3].

Typiquement, six cents composés étaient testés par an et par personne.

Mais devant ce faible débit et vu le coût de plus en plus élevé des tests in vivo , l’industrie pharmaceutique se tourna progressivement vers des méthodes originales alliant à la fois un débit élevé, la miniaturisation et l’automatisation en criblage et en synthèse pour accéder une plus grande diversité chimique.

La découverte de principes actifs

De 1975 à 1995, les essais des nouveaux composés étaient réalisés pour la plupart à l’aide de tests biochimiques en éprouvettes avec un débit d’environ dix composés par jour et par personne, soit 2000 composés par an et par personne. Dès 1995, ayant accès à des collections plus importantes étoffées entre autre par l’apport de la synthèse parallèle et/ou de la chimie combinatoire, la mise en place de criblage à haute capacité en micro-plaques de quatre-vingt seize puits et l’utilisation de la robotique de laboratoire augmenta le débit des tests biochimiques effectués de manière significative pour atteindre 2 000 tests par jour soit jusqu’à 400 000 tests par an. A partir de l’année 2000, on assista à une mini révolution avec l’introduction de robots « industriels » grâce auxquels 100 000 voire un million de tests pouvaient être effectués par jour en micro-plaques de 384 voire 1536 puits, sur un plus grand nombre de cibles clonées ou d’essais cellulaires : ceci correspond aujourd’hui à plus de cinquante millions de tests par an, en interne.

Comme pour toutes technologies nouvelles, il aura fallu une dizaine d’années pour maîtriser le criblage à haut débit et la chimie combinatoire et pour enfin récolter des résultats probants sur une variété de cibles thérapeutiques par la sélection d’un nombre croissant de candidats cliniques issus de la combinaison de ces technologies nouvelles [4]. Ces technologies, en tant que telles, quoique très performantes, ne sont cependant que des outils au service de la recherche pharmaceutique. Leur succès est totalement dépendant de la qualité intrinsèque et de la pertinence des collections criblées.

Les collections historiques.

Au début des années soixante-dix, les collections dites « historiques » que les compagnies pharmaceutiques avaient accumulées, étaient formées soit de produits préparés individuellement par les chimistes médicinaux, soit de produits naturels
isolés ou non. Les collections de synthèse étaient constituées principalement de produits analogues structuraux, appartenant à de grandes familles chimiques tels que bêta lactames, stéroïdes et autres benzodiazepines provenant essentiellement de programmes d’optimisation [5]. Le besoin de diversifier le type de structures chimiques pour soit trouver des réponses à des cibles thérapeutiques appartenant à des espaces biologiques nouveaux, soit pour étendre ou établir une propriété industrielle pour des familles de cibles connues, poussa l’industrie pharmaceutique dans son ensemble à rechercher des moyens rapides d’augmenter la diversité chimique et le nombre de molécules synthétisées à des coûts abordables.

La chimie combinatoire.

L’avènement de la chimie combinatoire au début des années quatre vingt-dix fit rapidement espérer que ce moment tant attendu fut enfin arrivé [6]. Les débuts de cette chimie aux antipodes de la synthèse traditionnelle furent spectaculaires à plus d’un point de vue en donnant notamment accès à des chimiothèques de dizaine de milliers voire millions de produits voisins. Plusieurs concepts originaux de production et de marquage furent découverts et développés au sein de quelques sociétés de biotechnologie ou « start-up » [7]. Une euphorie naïve, entretenue par un flot de publications par des consultants et analystes financiers de tous bords (et par les « start-up » elles-mêmes) vantant les mérites potentiels de ces approches, fit monter les enchères.

S’en suivit une succession d’acquisitions par de grands laboratoires pharmaceutiques de sociétés de chimie combinatoire comme par exemple : Affymax et Selectide acquis en 1995 respectivement par Glaxo Welcome [8] (aujourd’hui Glaxo Smith Kline) et Marion Merrell Dow [8] (aujourd’hui sanofi-aventis), Sphinx Pharmaceuticals en 1997 par Eli Lilly and Company [8] et Agouron en 1999 par Warner Lambert [9] (aujourd’hui Pfizer).

Les espoirs générés par ces méthodologies nouvelles furent à la taille de la déception qui en découla au milieu des années quatre vingt-dix, faute d’avoir pu rapidement produire et sélectionner des molécules suffisamment originales, stables et actives in vitro et surtout in vivo et ainsi infléchir le manque de productivité en candidats cliniques de l’industrie pharmaceutique dans son ensemble (Figure 1). Cette euphorie originelle était (volontairement ou non) ignorante des nombreuses difficultés à découvrir un principe actif nouveau. Il était en effet naïf de penser que toute structure chimique, quel que soit son poids moléculaire, sa polarité et/ou sa solubilité pouvait à priori être considérée comme médicament potentiel. La (soi-disant) diversité chimique nouvelle des débuts de la chimie combinatoire révéla ses limites.

Une palette restreinte de réactions chimiques sur phase solide (premières synthèses de ce type décrites pour des peptides en 1963 par Bruce Merrifield [10], Prix Nobel de Chimie en 1984) engendrait des structures qui bien qu’actives in vitro sur leur cible moléculaire, ne survivaient pas aux tests secondaires ou expérimentations in vivo .

FIG. 1. — Le Cycle des Technologies Nouvelles. Exemple de la Chimie Combinatoire.

L’enthousiasme initial tomba ainsi rapidement dû au manque de résultats convaincants et au très petit nombre de produits issus de cette approche atteignant les phases pré-cliniques et cliniques [11]. Bien que de nombreux éléments aient changé nos perspectives tant au niveau cible (ayant accès potentiellement, grâce au décryptage du génome humain [12], à un nombre considérable de cibles thérapeutiques nouvelles) qu’au niveau nombre et variété de ligands potentiels, l’objectif ultime d’administrer un traitement nouveau à un malade, lui, n’avait pas changé. Les obstacles à surmonter pour observer une activité par voie orale restaient et restent les mêmes à savoir : une bonne absorption, une distribution adaptée aux besoins thérapeutiques spécifiques, un métabolisme, une excrétion et une toxicité (ADME-T) acceptables.

Selectide

Selectide, une start-up nichée à Tucson (USA), fut fondée au début des années quatre vingt-dix par quatre professeurs de l’Université d’Arizona : les professeurs S.

Salmon, K. Lam, E. Hersch et V. Hruby [13]. Sur la base d’une technologie propriétaire de synthèse par répartition et mélange (appellée « split and mix ») ils démontrèrent dans un premier temps la puissance de leur concept OBOC (ou One Bead One Compound ou Une Bille Un Produit ) en synthétisant des chimiothèques comportant des centaines de milliers voire millions de structures de type peptidiques ou peptidomimétiques. De 1995 à nos jours, en reprenant le problème à l’envers, et en considérant dès le départ les propriétés qu’une molécule se devait de posséder
pour espérer être active in vivo , Selectide, dans le cadre successivement de Marion

Merrell Dow, Hoechst Marion Roussel, Aventis et finalement sanofi-aventis fit évoluer continuellement ses technologies et surtout sa chimie pour les mettre en phase avec les besoins réels de la recherche pharmaceutique [14]. Vers la fin des années quatre vingt-dix, un programme d’échanges entre chimistes médicinaux des divers domaines thérapeutiques du groupe et chimistes « locaux » experts en synthèse sur support solide favorisa une émulation et un respect réciproque entre chercheurs et permit d’explorer ensemble le potentiel et les limites de la chimie combinatoire d’un côté et les règles de base de la chimie médicinale de l’autre.

Notre centre de chimie combinatoire est passé en une dizaine d’années de la production de produits sous forme de mélanges codés ou non en très faible quantité (technologie « OBOC »), à une production de petits mélanges ou produits individualisés par synthèse de plus en plus parallèle, pour finir par adopter et utiliser en routine aujourd’hui une technologie mise au point par IRORI (une société de biotechnologie californienne) pour le compte de Rhône Poulenc Rorer et BristolMyers Squibb [15] et qui a le mérite d’allier à la fois la qualité, la traçabilité (ou codage) et de moduler quantité et taille en fonction des besoins en petites ou en grandes chimiothèques (Figure 2).

FIG. 2. — Évolution de la Chimie Combinatoire au Centre s-a de Technologies Combinatoires On peut ainsi synthétiser en quantités variables des milliers de composés individuels sur des billes de polymère réparties au départ dans des capsules (ou Nanokans )
scellées par des couvercles en céramique, ces couvercles comportant sur leur dessus un code barres à deux dimensions à lecture optique. A chaque capsule correspondra un code unique et par conséquent un produit unique identifié. Ces capsules possè- dent des parois à filets laissant passer les réactifs et solvants de lavage et permettant après triage et redistribution d’effectuer les différentes étapes de synthèse. Une série de stations de travail sophistiquées est nécessaire au remplissage automatisé, au scellage haut débit des capsules par les couvercles en céramique, à la répartition programmée des « Nanokans » dûment remplies dans les différents réacteurs au sein desquels se feront les étapes successives de synthèse et de lavage (pour enlever les excès de réactifs). Une fois le cycle de production complété, le transfert final de ces capsules dans des plaques spéciales de quatre vingt-seize puits permet d’y effectuer la coupure et l’extraction par de l’acide trifluoroacétique des produits de leur support solide. L’évaporation du solvant donnera accès aux molécules attendues, en plaques, prêtes à être criblées (Figure 3). Ces chimiothèques de 500 à 100 000 produits individualisés bruts sont testées sur des cibles ou dans des essais cellulaires telles que ou préalablement purifiées par chromatographie phase inverse haute pression à haut débit [16].

FIG. 3. — Description du Système « Nanokans » Identification de têtes de séries optimisables

La densité et la diversité du portefeuille de programmes pour l’identification de touches (hits) ou têtes de série (leads) actuellement en cours témoigne de la qualité,
de l’importance et de la constance des résultats obtenus par Selectide (aujourd’hui S-ACTC ou Sanofi-Aventis Combinatorial Technology Center) durant ces sept à huit dernières années. La collection dite « combinatoire » est à ce jour composée d’environ un million de molécules provenant de près d’une centaine de chimiothèques originales. Sa diversité chimique est parfaitement complémentaire de celle de notre collection « historique » ou « médicinale » ce qui lui confère un rôle primordial dans le cas de cibles ou essais cellulaires réputés « difficiles ». Tous les domaines thérapeutiques en bénéficient en fonction de la difficulté et du type de cibles considérées.

Au niveau produits, la conception par nos modélisateurs de chimiothèques combinatoires nouvelles prend en compte systématiquement des filtres permettant d’estimer par exemple les propriétés physico-chimiques de nos différents produits proposés. Des règles empiriques basées sur l’analyse statistique des propriétés physicochimiques de médicaments sur le marché ont été formulées par C. Lipinski [17]. Ces « règles de Lipinski » ou « règles des 5 » permettent de sélectionner, parmi toutes les possibilités qu’offrent les chimies, des structures dont les chances de passer les différentes barrières biologiques et par conséquent d’avoir une biodisponibilité par voie orale raisonnable sont accrues. Nos conceptions de chimiothèques se basent également sur des motifs chimiques privilégiés interagissant préférentiellement avec par exemple des familles de cibles telles que canaux ioniques ou récepteurs couplés aux protéines G. Lorsque disponibles, les données cristallographiques de nos cibles y sont également incorporées. Ceci est le cas des protéines kinases et des protéases. Mais la conception peut également être basée purement sur des chimies nouvelles impliquant des formations de cycles multiples ou mimant des produits naturels [18]. De plus, de par l’intégration de la chimie, de la biologie, des méthodes analytiques et des sciences informatiques, l’exploitation des résultats biologiques obtenus pour une chimiothèque donnée permet de concevoir et de produire de manière itérative des librairies propriétaires de deuxième génération aux propriétés améliorées (Figure 4).

Au niveau des cibles, des études récentes ont montré que la recherche de nouveaux médicaments passe logiquement par l’identification d’une cible biologique qui peut non seulement jouer un rôle dans un processus pathologique mais également être modulable par un ligand ou médicament. Actuellement, 45 % de toutes les cibles thérapeutiques existantes sont des récepteurs d’hormones et de neurotransmetteurs et 28 % sont des enzymes. Le taux d’échec en découverte de nouveaux médicaments pour de nouvelles classes de cibles reste élevé [19].

La probabilité d’obtenir à Tucson des résultats positifs lors du criblage de familles de cibles aussi diverses que protéases, kinases, phosphatases, récepteurs couplés aux protéines G (orphelins ou non), canaux ioniques ou oxidases mais également pour des essais phénotypiques s’est nettement accrue ces dernières années. Le succès de notre approche « chimie combinatoire » ne se mesure bien entendu pas uniquement par l’identification de composés têtes de série mais également et surtout par le nombre respectable de molécules « leads » optimisées (ou non) par les chimistes médicinaux et ayant atteint les phases de développement préclinique et clinique.

FIG. 4. — Cycle de Conception de Chimiothèques Nouvelles et d’Identification de « Leads » En conclusion, comme démontré par de nombreux collègues de laboratoires universitaires ou industriels concurrents, nous pouvons affirmer qu’aujourd’hui le potentiel réel de l’approche « Chimie Combinatoire (en phase solide ou liquide) associée au criblage à haut-débit » à apporter des réponses en nouveaux candidats médicaments a été atteint [20]. Les taux de succès n’ont plus grand-chose à envier à ceux obtenus par criblage de chimiothèques ‘‘ historiques ’’ plus traditionnelles. La complémentarité de ces technologies avec des approches in silico en criblage virtuel (basé soit sur les connaissances structurales et le « docking » soit par interrogation à haut flux de banque de données de composés réels ou virtuels pour l’identification d’analogues structuraux proches) constitue un atout supplémentaire non négligeable [21]. De nouvelles techniques d’imagerie permettront dans le futur proche de développer des essais cellulaires phénotypiques et d’appliquer notre patrimoine chimique combinatoire et médicinal à la découverte de modulateurs de cibles moléculaires plus complexes [22].

REMERCIEMENTS

Les auteurs remercient Marcel Patek et Ken Wertman du Centre Sanofi-Aventis de Technologies Combinatoires (S-ACTC) à Tucson, AZ, USA.

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DISCUSSION

M. Raymond ARDAILLOU

Le choix des molécules « leads » se fait-il en utilisant des cibles moléculaires ou cellulaires ?

Le choix des molécules « leads » se fait en utilisant des essais sur cibles moléculaires lorsqu’accessibles, couplés à des essais cellulaires de confirmation d’activités comme pour les kinases par exemple. Les molécules « leads » peuvent également être identifiées directement dans des essais cellulaires (lignées cellulaires surexprimant par exemple certains récepteurs clonés) ou essais phénotypiques (cible inconnue).

M. Pierre JOLY

Pourriez-vous rappeler le principe même de la chimie combinatoire ?

A ses débuts, la chimie combinatoire consistait à effectuer en quelques étapes la synthèse des grandes librairies de peptides ou peptido-mimétiques sur support solide (polymère) par des méthodes de type « split and mix » (ou « répartition — mélange ») ou synthèse parallèle. Les avantages de la synthèse sur support solide sont multiples (par exemple :

identification aisée des différents composants d’une chimiothèque à l’aide de marquages divers, purification sur support par lavages entre les étapes afin d’éliminer les excès de réactifs nécessaires à l’obtention de rendements élévés à chaque étape). Ce principe a progressivement évolué vers des chimies nouvelles donnant accès à des produits hétérocycliques tout en gardant les avantages cités ci-avant.

M. Pierre AMBROISE-THOMAS

Quels sont les « filtres successifs », les méthodes de criblage vous permettant une sélection préalable, parmi la multitude de « molécules prometteuses », celles qui ont des chances raisonnables de devenir des médicaments véritables à l’issue des différentes phases du développement pré-clinique et clinique ?

Les « filtres successifs » permettant de sélectionner les « molécules les plus prometteuses » sont multiples. Ceux-ci comprennent des filtres couvrant les propriétés physicochimiques, la perméabilité membranaire, la stabilité métabolique, la sélectivité en terme d’activité envers un très grand nombre de cibles moléculaires non désirées, l’inhibition ou activation d’enzyme à cytochromes impliqués dans la métabolisation, l’inhibition de certains canaux ioniques pouvant conduire à des effets cardiovasculaires indésirables, etc.

M. Jean-Paul GIROUD

Combien de molécules obtenues par chimie combinatoire sont actuellement en phase préclinique et clinique dans votre laboratoire ?

Durant les huit dernières années, deux produits issus de notre chimie combinatoire ont atteint les phases précliniques, l’un d’eux ayant progressé jusqu’en clinique. De plus, une bonne dizaine de nos molécules sont à l’heure actuelle en phase d’optimisation avancée en recherche amont.

M. Jean COSTENTIN

Votre exposé a relativisé la démarche rationnelle qui sous tend la vôtre, qui ne saurait être que quantitative. La qualité n’étant pas seulement un sous-produit de la quantité. Voudriezvous nous éclairer à cet égard ?

D’autres approches comme la conception rationnelle de médicaments à l’aide de structures tridimensionnelles des cibles moléculaires, lorsqu’accessibles, contribuent également à l’identification de molécules « leads » et sont très complémentaires des méthodes de criblage et de chimie combinatoire. En effet, des chimiothèques originales peuvent être conçues sur la base d’informations structurales et de concepts rationnels émanant de complexes ligands — cibles. Les grands nombres (la quantité) n’excluent bien entendu pas la qualité, au contraire. Ils ne peuvent mener au succès final que si toutes les étapes allant de la conception des chimiothèques, au développement des essais, à la synthèse proprement dite, au criblage et à la confirmation des « leads » sont effectuées avec un souci constant de qualité.


* Sanofi-Aventis, Centre de recherche, 13 quai Jules Guesde, 94403 Vitry-sur-Seine. Tirés-à-part : Docteur Daniel SCHIRLIN, même adresse. Article reçu et accepté le 12 mars 2007.

Bull. Acad. Natle Méd., 2007, 191, nos 4-5, 727-737, séance du 3 avril 2007