Communication scientifique
Session of 6 mars 2001

Expression de la N0 synthase inductible et production du monoxyde d’azote par les cellules mononucléées sanguines dans la sclérodermie systémique

MOTS-CLÉS : azote monoxyde, métabolisme.. sclérodermie généralisée, physiopathologie
Nitric oxide production and inducible nitric oxide synthase expression by monocytes in systemic sclerosis
KEY-WORDS : nitric oxide, metabolism.. scleroderma, systemic, physiopathology

Ch. J. Menkès, Y. Allanore, D. Borderie, P. Hilliquin, A. Hernvann, O. Ekindjian, A. Kahan

Résumé

La sclérodermie diffuse est une maladie du tissu conjonctif caractérisée par des lésions vasculaires et l’accumulation de collagène. Sa pathogénie exacte est encore inconnue, mais on sait que le spasme vasculaire a un rôle important. Cela nous a conduit à étudier la production du monoxyde d’azote (NO) et de la NO synthase inductible (NOSi) par les mononucléaires sanguins. Dix-huit malades atteints de sclérodermie ont été comparés, à titre de contrôle, à 16 cas de polyarthrite rhumatoïde et 23 cas de sciatique. La concentration en nitrites et nitrates dans le plasma et dans le surnageant de culture a été déterminée par fluorimétrie. L’expression de NOSi a été étudiée pendant 5 jours, dans les cultures cellulaires, avant et après l’action de différentes cytokines par immunofluorescence, immunoempreinte et cytométrie en flux. Il a été mis en évidence une diminution significative des concentrations des métabolites du NO dans le plasma et un retard d’induction de la NO synthase dans les cultures cellulaires des sclérodermies. Ce déficit en NO, qui est un vasodilatateur puissant, pourrait favoriser les lésions vasculaires de la maladie avec d’éventuelles implications thérapeutiques.

Summary

We investigated nitric oxide (NO) production and inducible NO synthase (iNOS) expression by cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in systemic sclerosis (SSc). Eighteen patients with SSc were compared to two control groups :16 rheumatoid arthritis patients (RA) and 23 mechanical sciatica patients. The sum of nitrites and nitrates was determined by fluorimetry in sera and spectrophotometry in supernatants. Inducible iNOS was detected in cultured PBMC by immunofluorescence, immunoblot and flow cytometry with or without IL-1 β + TNF α , IL-4 or IFN γ from day 1 to day 5. NO metabolite concentrations in the plasma were lower in SSc (34.3 µ mol/l fi 2.63 SEM) than in RA (48.3 µ mol/l fi 2.2 ; p<0.02) and sciatica (43.3 µ mol/l fi 5.24 ; p<0.03) patients. iNOS was detected in cultured monocytes in the 3 groups but induction occured on day 1 in RA, day 2 in sciatica and only on day 3 in SSc, whatever the stimulus. The concentrations of NO metabolites are decreased in SSc patients and the induction of iNOS in PBMC is delayed. Low levels of NO, a vasodilator, may be involved in vasospasm, which is critical in SSc. This may suggest therapeutic implications.

Expression de la NO synthase inductible et production du monoxyde d’azote par les cellules mononucléées sanguines dans la sclérodermie systémique

Nitric oxide production and inducible nitric oxide synthase expression by monocytes in systemic sclerosis

Charles-Joël MENKÈS*, Yannick ALLANORE*, Didier BORDERIE**, Pascal HILLIQUIN*, Alain HERNVANN**, Ohvanesse EKINDJIAN**, André KAHAN*

INTRODUCTION

La sclérodermie diffuse est une maladie du tissu conjonctif caractérisée par des lésions vasculaires et l’accumulation de collagène. Sa pathogénie exacte est encore inconnue, le spasme vasculaire a un rôle important. Il explique le syndrome de Raynaud ainsi que les lésions cardiaques et rénales [1]. L’étude de l’endothélium vasculaire a montré une augmentation de la production d’un peptide vasoconstricteur, l’endothéline [2], et on a récemment évoqué la possibilité d’un défaut de libération du monoxyde d’azote (NO) par cet endothélium après stimulation au froid [3]. Le NO agit normalement comme un vasodilatateur et un défaut de production du NO a été évoqué dans certaines maladies comme l’hypertension artérielle, l’artériosclérose et le spasme vasculaire [4, 5].

L’interaction entre les mononucléaires et les cellules endothéliales est un élément essentiel du développement des maladies vasculaires [6]. Dans la sclérodermie, ils interviennent dans l’apparition des lésions vasculaires et le développement de la fibrose par des réactions intercellulaires avec production de cytokines, de collagène et de glycosaminoglycanes [7, 8]. L’étude histologique des lésions cutanées sclérodermiques a montré l’existence précoce de lésions endothéliales et d’infiltrats de mononucléaires [9]. Ces infiltrats cutanés prédominent dans les espaces périvasculaires, autour des petits vaisseaux [10]. Dans les cultures de tissu, la migration des mononucléaires à travers la couche de cellules endothéliales se fait sous l’action des fibroblastes qui produisent une protéine chimiotactique, la MCP-1 (monocyte chemoattractant-protein-1) [11].

Le monoxyde d’azote est synthétisé par différentes isoformes de NO synthase (NOS) [12]. La NO-synthase inductible de type 2 (NOSi) produit de grandes concentrations de NO. Celui-ci est cytotoxique mais aussi immunorégulateur [13].

Les monocytes humains produisent du NO en relation avec les récepteurs CD23 et sous l’effet de différents stimuli tels l’interféron γ ( IFN γ), l’interleukine 4 (IL-4) et le facteur de nécrose tumorale α ( TNF α) [14]. Différentes cytokines sont impliquées dans la sclérodermie. Dans le sérum, on trouve des concentrations élevées de TNF α, d’interleukine-1 β (IL-1β), d’IL-2, IL-4, IL-6 et IL-8 et les mononucléaires produisent de grandes quantités de TNFα, IL-1β et IL-4 [15, 16]. En revanche, le taux d’interféron γ y est diminué [16, 17].

Notre étude porte sur la production de NO par les mononucléaires du sang périphérique dans l’hypothèse d’un défaut de production pouvant expliquer les anomalies de vasodilatation chez les sclérodermiques. Nous avons mesuré les métabolites du NO dans le plasma et dans le surnageant des mononucléaires ainsi que l’induction de NO synthase par les mononucléaires sous l’effet de différentes cytokines.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Les malades

Dix-huit malades atteints de sclérodermie systémique (Scl) ont été inclus. Ils répondaient tous aux critères de l’American College of Rheumatology (anciennement appelé American Rheumatism Association) [18]. Treize malades avaient une sclérodermie diffuse et 5 une atteinte cutanée plus limitée selon les critères de Leroy [19].

Les données cliniques, thérapeutiques et biologiques ont été précisées au moment des prélèvements sanguins.

Ces malades ont été comparés à deux groupes contrôles. Seize malades atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR) constituaient un groupe contrôle positif car, dans cette maladie, il existe un excès de NO et de NOSi [20]. Dans tous ces cas la PR répondait aux critères révisés en 1987 de l’American Rheumatism Association [21]. Vingt-trois cas de sciatique banale formaient le groupe contrôle négatif. Les anti-inflammatoires, stéroïdiens ou non, étaient autorisés, mais ils devaient être suspendus 24 heures avant la prise de sang. Les traitements de fond de la sclérodermie et de la PR devaient être sans modification depuis au moins trois mois. Les inhibiteurs des canaux calciques étaient autorisés. Pour compléter les groupes contrôles, 5 volontaires sains avaient accepté un prélèvement sanguin pour l’étude des métabolites du NO.

Prélèvement sanguin

Trente millilitres de sang ont été recueillis sur EDTA pour chaque sujet après consentement éclairé. L’étude a été approuvée par le CCPPRB de l’hôpital Cochin ;

elle avait comme promoteur l’Assistance publique des Hôpitaux de Paris.

Cultures cellulaires

Les mononucléaires ont été séparés par gradient de densité à l’aide d’un milieu de séparation des lymphocytes (25 minutes,150 g et Ficoll/Hypaque de densité 1,077 — Eurobio, France). Les cellules ont été lavées deux fois avec une solution RPMI 1640 (Eurobio, France). Il y avait en moyenne 20 % de monocytes et 80 % de lymphocytes. Les cellules ont été cultivées à différents niveaux de densité : 5 × 105 pour 0,2 ml de milieu pour les mesures de surnageant et 5 × 105 pour 5 ml de milieu pour l’étude de la NOSi. Le milieu utilisé était du RPMI 1640 avec en supplément 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Bioproducts, Boehringer Ingelheim) avec ou sans IFNγ(100 UI/ml), TNFα(5 ng/ml), IL-1β(10 ng/ml), IL-4 (5ng/ml), IL-1β plus TNFα, IL-1β (10ng/ml) plus TNFα plus IFNγ, LPS (10 ng/ml).

Il s’agissait de formes recombinantes de cytokines humaines (Sigma Aldrich, SaintLouis, Etats-Unis). Les cellules ont été cultivées pendant 1 à 5 jours, puis le surnageant prélevé pour la détermination des concentrations en nitrites totaux.

Expression de la NOSi dans les cultures des mononucléaires du sang périphérique

Immunofluorescence

Les cellules ont été cultivées sur lame de verre puis fixées et perméabilisées par incubation avec un mélange d’acétone/méthanol à -20°C pendant 10 minutes et ensuite réhydratées avec une solution d’albumine bovine à 1 % dans le PBS. Les lames ont été incubées pendant 1 heure à la température de 37° C avec un anticorps monoclonal de souris anti-NOSi (Interchim, États-Unis), ou de l’Ig de souris comme contrôle négatif. Enfin, les lames ont été incubées avec un anticorps anti-IgG de souris couplé à l’isothiocyanate de fluorescéine (Interchim, États-Unis).

Immuno-empreinte

Nous avons utilisé un anticorps monoclonal anti-NOS2 (Transduction Laboratories, États-Unis) à la dilution de 1/1000 et un substrat Opti-4-cn (Bio-Rad, Hercules, États-Unis). La présence d’une bande à 130 kDa définissait un résultat positif.

Cytométrie en flux

Pour quantifier l’expression intracellulaire de la NO synthase et des récepteurs membranaires CD23 dans les cultures de mononucléaires, nous avons utilisé l’analyse par cytométrie en flux (FACS) [23]. L’anticorps monoclonal anti-CD23 conjugué à la R-phycoérythrine (Becton-Dickinson, États-Unis, 15 µl/ml de solution pendant 20 minutes) a été utilisé. Les cellules ont été perméabilisées (solution perméabilisante FACSTN, Becton-Dickinson, États-Unis) puis lavées au PBS et incubées avec un anticorps monoclonal anti-iNOS conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (Transduction Laboratories Interchim, États-Unis). L’analyse des données a été réalisée sur un logiciel Lysis II (Becton-Dickinson, États-Unis). La
répartition monocytes/macrophages a été définie sur la base de la taille et de la granularité des cellules. Un minimum de 2 000 cellules a été analysé par échantillon.

Mesure de la concentration en nitrites totaux

Les nitrites totaux ont été déterminés dans le plasma et les surnageants par spectrophotométrie selon la réaction de Griess après réduction chimique des nitrates par le cadmium. Ainsi, après cette réduction, la mesure des nitrites totaux apprécie la production de NO.

Après précipitation des protéines par le sulfate de zinc, le surnageant est incubé avec 0,5 g de cadmium métal par tube une nuit sous agitation. Après centrifugation à 3 000 RPM pendant 5 minutes, 50 µl de surnageant sont distribués dans une microplaque avec 50 µl de sulfanilamide à 5 g/l en milieu phosphorique à 5 % et 50 µl de N-(1-naphtyl)éthylènediamine à 0,5 g/l et incubés pendant 10 minutes à température ambiante. La lecture de l’absorbance s’effectue à 540 nm sur un spectrophotomètre microplaque (MR5000, Dynex). Une gamme d’étalonnage a été faite à partir d’une solution de nitrate de sodium (0,05-50 µmol/l) [22].

Analyse statistique

Les résultats ont été analysés par des tests non paramétriques : Mann Whitney et Kruskall-Wallis (logiciel Statview). Une valeur de p. inférieure à 0,05 a été retenue comme significative.

RÉSULTATS

Concentration plasmatique des nitrites totaux après réduction des nitrates

La concentration des métabolites du NO (nitrites totaux) était plus basse dans la sclérodermie (34,3 µmol/lfi 2,63) que dans la PR (48,3 µmol/l fi 2,82 ; p. < 0,02) et dans la sciatique (43,3 µmol/l fi 5,24 ; p. < 0,03) (Fig. 1). Il n’y avait pas de différence significative entre la sclérodermie à forme diffuse (34,4 µmol/l ; n = 13) et la sclérodermie à forme limitée (34,1 µmol/l ; n = 5). Pour les volontaires sains, la concentration des nitrites totaux était de 40,8 fi 1,2 µmol/l.

Métabolites du NO dans les surnageants de culture des mononucléaires

Le surnageant a été analysé au 5ème jour de la culture. Quel que soit le stimulant utilisé, aucune concentration en nitrites totaux n’a été détectée chez les malades et les contrôles.

FIG. 1. — Concentration plasmatique en nitrites totaux.

Synthèse de la NOSi dans les cultures de mononucléaires

Du premier au cinquième jour, la NOSi a été recherchée par immunofluorescence dans les cultures cellulaires avec ou sans IL-1β plus TNFα, IL-4 ou IFNγ. Nous avons trouvé que les monocytes/macrophages expriment la NOSi dès J1 dans la PR, J2 dans la sciatique et seulement à J3 dans la sclérodermie. La plus grande production de NOSi a été obtenue avec l’IFNγ pour tous les groupes étudiés avec persistance de l’expression à J5.

Des immuno-empreintes ont été faites de J1 à J5 avec ou sans IL1-β + TNFα, IL-4 et IFNγ. Les résultats obtenus étaient concordants avec ceux de l’immunofluorescence. La Figure 2 montre la synthèse de NOSi après stimulation avec l’IFNγ dans la sclérodermie et la PR.

Cinq échantillons de chaque groupe ont été étudiés par cytométrie en flux pour l’expression de la NOSi et du récepteur CD23 de J0 à J5 avec ou sans IL-1β +TNFα, IL-4 et IFNγ. Les résultats de la cytométrie sont exprimés en pourcentage de monocytes/macrophages exprimant de la NOSi (Fig. 3). Dans la sclérodermie, l’induction de NOSi était observée à J3, quelles que soient les conditions de culture et était maximum après addition d’IFN γ (37 % de monocytes activés) avec une décroissance après J3 qu’il y ait ou non de l’Il-1β et du TNFα. Dans la PR, une induction de NOSi a été observée dans tous les cas à J1 avec augmentation de la synthèse jusqu’à J5. Pour la sciatique, l’induction est apparue à J2, intermédiaire entre sclérodermie et PR, avec ou sans cytokine. Des différences significatives ont été

FIG. 2. — Immuno-empreinte de la NOSi à partir des cellules mononucléées circulantes en culture de J1 à J5, sous l’effet de l’interféron γ.

observées (Fig. 3) : à J1, avec ou sans IL-4 ou IFN γ ; à J2 sans cytokine et avec Il-1 β + TNF α ; à J5 sans cytokine et avec IL-1β + TNF α. Les quantités de NOSi étaient supérieures dans la PR par rapport à la sciatique à J1, pour les cultures traitées par IFN γ ou IL-1β + TNF α et à J2 après addition d’IFN γ aux cultures (Fig. 3).

L’expression du récepteur CD23 par les monocytes/macrophages a été étudiée par cytométrie en flux. A J0, cette expression était plus importante dans la PR. Les résultats ont été exprimés en % de mononucléaires positifs fi SEM : 5,9 fi 1,4 dans la sclérodermie, 18,3 fi 5,5 dans la PR, 5,8 fi 1,3 dans la sciatique (p < 0,03). Les jours suivants, quelle que soit la cytokine ajoutée, il n’y avait pas de différence significative entre les groupes (Tableau 1).

DISCUSSION

Les résultats de cette étude mettent en évidence une diminution de la concentration plasmatique du NO et un retard de la synthèse de la NOSi par les monocytes/macrophages en culture dans la sclérodermie systémique.

Une analyse en sous-groupe n’a pas montré de différence entre sclérodermie limitée et diffuse. La concentration plasmatique en nitrites totaux des cinq volontaires sains était identique à celle des malades atteints de sciatique confirmant le bien-fondé de ce groupe contrôle. La concentration en nitrites totaux dans la PR correspondait à ce qui est habituellement décrit : Grabowski et coll. [24] ont trouvé 38 fi 14 µmol/l et Hilliquin et coll. [25], 61,5 fi 32,7 µmol/l. La concentration plasmatique en nitrites totaux était supérieure dans la PR par rapport à la sciatique sans que la différence soit significative. De nombreux traitements tels les AINS [26], les corticoïdes [25] et le méthotrexate [27] diminuent la production de NO. Dans notre étude,
.

monocytes les par NOSi la de ession e xpr :

flux en Cytométrie — .

3 .

IG F

TABLEAU 1. — Expression du récepteur CD 23 par les monocytes en culture.

Influence de l’IL-4 et de l’IFN-γ (moyennes des % de cellules marquées fi SEM).

J0*

J1

J2

J3

J5

Scl 5,9 (fi 1,4) 8,4 (fi 1,2) 30,3 (fi 2,2) 55,7 (fi 2,1) 19,3 (fi 1,9) PR 18,3 (fi 5,5) 19,6 (fi 2,6) 35,1 (fi 2,3) 35,6 (fi 12,8) 42,3 (fi 6,8) Sciatique 5,8 (fi 1,3) 13,8 (fi2,4) 35,8 (fi 1,9) 52,5 (fi 4) 18,2 (fi 3,2) Scl + IFN-γ – 15,4 (fi 0,5) 25,7 (fi 1,6) 42,8 (fi 2,7) 25,7 (fi 2,7) PR+ IFN-γ – 22,2 (fi 2,3) 50,2 (fi 6,2) 52 (fi 5,6) 50,9 (fi 4,8) Sciatique + – IFN-γ 27,8 (fi 6,2) 33,2 (fi 1,7) 52,1 (fi 6,2) 19,9 (fi 1,2) Scl + IL-4 – 44,1 (fi 1,7) 61,7 (fi 2,5) 69,1 (fi 1,9) 29,5 (fi 1,1) PR + IL-4 – 59,7 (fi 5,4) 65,6 (fi 1,3) 52,9 (fi 14) 59,7 (fi 7,6) Sciatique + – IL-4 37,5 (fi 5) 64,2 (fi 2,4) 58,6 (fi 4,5) 24,7 (fi 6,4) *p< 0,03 (test de Kruskall-Wallis ; pour les 3 groupes de patients à ce jour) la diminution de la production de NO par les malades atteints de sclérodermie n’était pas due à ces traitements étant donné la faible dose de corticoïdes utilisée en moyenne (3,7 mg/j dans la sclérodermie ; 7,4 mg/j dans la PR), et peu de malades avaient reçu des AINS (2 dans la sclérodermie, 5 dans la PR, 7 pour la sciatique) ou du méthotrexate (1 cas pour la sclérodermie, 9 pour la PR, aucun pour la sciatique).

L’effet des inhibiteurs des canaux calciques est mal connu [28, 29]. Nous avons donc comparé les sous-groupes de sclérodermie ou de sciatique traités par des inhibiteurs des canaux calciques et noté que la concentration en nitrites totaux était de 33,9 µmol/l dans le sous-groupe des sclérodermies (n = 12) alors qu’elle était plus importante, à 50,4 µmol/l, dans le groupe témoin de sciatique (n = 7). La baisse de concentration en nitrites totaux chez les sclérodermiques ne semble donc pas liée au traitement par les inhibiteurs des canaux calciques. Nos résultats concordent avec ceux de Kahaleh [30], qui a trouvé un taux plasmatique de NO, par chimioluminescence, inférieur dans la sclérodermie (25,8 fi 1,3 µmol/l) en comparaison à des contrôles sains (35,5 fi 2,1 µmol/l).

En revanche, Yamamoto [31] a trouvé des valeurs de nitrites supérieures chez les sclérodermiques (47,8 fi 17 µmol/l) par rapport à celles des sujets sains (25,6 fi 10,3 µmol/l). Ce résultat est d’autant plus étonnant que les concentrations en nitrites sont habituellement comprises entre 1 et 7 µmol/l [32]. Dans le sang, les nitrites sont en effet rapidement oxydés en nitrates en présence d’hémoglobine [33].

Dans la sclérodermie, il existe un défaut de production du NO par la cellule endothéliale, probablement en raison d’une moindre expression du gène de la NO
synthase [3, 34]. Nous nous sommes intéressés aux mononucléaires trouvés à un stade précoce des lésions sclérodermiques où ils produisent de nombreux médiateurs [7, 10] et libèrent du NO qui peut influencer les phénomènes vasculaires locaux.

Nous avons mesuré la production de NO dans le surnageant des mononucléaires après cinq jours de culture avec différents effecteurs. Il n’a pas été possible d’en mettre en évidence dans la sclérodermie, ni dans le groupe contrôle, ni chez les volontaires sains. Une production de NO par les macrophages de rongeurs, en culture, a été mise en évidence [35] mais dans de nombreux travaux cela n’a pas été possible pour les monocytes/macrophages humains en culture sinon à des taux très faibles [36, 37]. Cependant, une activité et une production de NO synthase ont été mises en évidence [14, 38]. Il est possible que certains cofacteurs manquants ou un processus de signalisation intracellulaire particulier soient nécessaires pour obtenir une activité de NOSi efficace. A noter cependant, que Yamamoto et coll. [39] ont trouvé une augmentation de la production de NO après stimulation des mononucléaires de sclérodermie par l’IL-1β.

L’expression de la NOSi était retardée dans la sclérodermie jusqu’à J3, quelle que soit la stimulation en milieu de culture, pour devenir presque indétectable après cinq jours sauf en présence d’IFN γ ou d’IL-4. La persistance de l’expression de la NOSi à J5 dans la PR est en accord avec ce qui est déjà connu [20] dans cette maladie. Dans les trois groupes de malades, l’interféron γ était le plus puissant inducteur de la NOSi. La concentration d’IFN γ est diminuée dans la sclérodermie [13, 17], ce qui est en accord avec la diminution de synthèse de la NOSi.

Il a été mis en évidence une activation du métabolisme du NO dans les mononucléaires humains par fixation sur le récepteur CD23 [14]. L’analyse par cytométrie en flux a montré que l’expression du CD23 était augmentée dans la PR à J0, pouvant ainsi expliquer l’induction précoce de la NOSi. Notre étude a montré que dans la sclérodermie, le retard à l’induction de la NOSi n’était pas lié à une diminution des récepteurs CD23. Il serait sans doute intéressant d’étudier la fonctionnalité de ce récepteur dans cette maladie.

Le rôle du NO dans la sclérodermie est discuté. Certains travaux suggèrent que l’activité NO est augmentée dans les mononucléaires et polynucléaires [40] et dans la peau [41]. Il est possible que les résultats varient selon les tissus étudiés et l’activité de la maladie. En revanche, la notion d’un défaut de production du NO dans la sclérodermie est confirmée par les résultats de Kahaleh et coll. [30, 34] et par une étude récente montrant que des perfusions intra-artérielles de L-arginine et de nitroprussiate de sodium diminuent de façon significative l’incidence du syndrome de Raynaud induit chez les malades atteints de sclérodermie [42]. Il est également possible que les inhibiteurs des canaux calciques, qui jouent un rôle important dans le traitement de la sclérodermie [1, 43, 44], puissent favoriser la libération de NO [29, 45].

CONCLUSION

Les anomalies vasculaires constituent un élément majeur de la physiopathologie de la sclérodermie. Nos résultats, comme ceux de Kahaleh [3, 30, 34], montrent que la production de NO est diminuée dans la sclérodermie, ce qui pourrait expliquer la tendance au spasme vasculaire dans cette maladie.

Le traitement de la sclérodermie est aujourd’hui encore décevant, notamment dans les formes avec atteinte vasculaire sévère. L’utilisation des prostacyclines, du monoxyde d’azote et des nouveaux antagonistes des récepteurs de l’endothéline devrait permettre d’améliorer le pronostic de ces formes graves [46].

REMERCIEMENTS

Nous remercions très vivement Maryse Levacher et Hervé Lemaréchal pour leur participation active à cette étude. Yannick Allanore a bénéficié d’une bourse du Fond d’Etude et de Recherche de l’Assistance Publique-Hôpitaux de Paris et de la Société Française de Rhumatologie.

BIBLIOGRAPHIE [1] KAHAN A., DEVAUX J.Y., AMOR B., MENKÈS C.J., WEBER S., NITENBERG A., VENOT A., GUERIN F., DEGEORGES M., ROUCAYROL J.C. — Nifedipine and thallium-201 myocardial perfusion in progressive systemic sclerosis. N. Engl. J. Med ., 1986, 22 ,1397-1402.

[2] KAHALEH M.B. — Endothelin, an endothelial-dependent vasoconstrictor in scleroderma :

enhanced production and profibrotic action. Arthritis Rheum. , 1991, 34 , 978-983.

[3] KAHALEH B., MATUCCI-CERENIC M. — Raynaud’s phenomenon and scleroderma. Dysregulated neuroendothelial control of vascular tone. Arthritis Rheum ., 1995, 38 , 1-4.

[4] CANNON R.O. — Role of nitric oxide in cardiovascular disease : focus on the endothelium.

Clin.

Chem ., 1998, 44 , 1809-1819.

[5] SUZUKI M., OGAWA A., ASAHARA H., ENDO S., INADA K. — Nitric oxide and vasospasm.

J

Neurosurg. , 1997, 4 , 741-742.

[6] ARTIGUES C., RICHARD V., THUILLEZ C. — Evaluation of the effects of experimental hypertension on monocyte-endothelial cell interactions . Arch. Mal. Cœur Vaiss ., 1998, 8 , 1031-1034.

[7] KAHALEH M.B. — Lymphocyte interactions with the vascular endothelium in systemic sclerosis.

Clin Dermatol ., 1994, 12 , 361-367.

[8] KAHALEH M.B. — Soluble immunologic products in scleroderma sera . Clin. Immunol. Immu- nopathol ., 1991, 58 , 139-144.

[9] PRESCOTT R.J., FREEMONT A.J., JONES C.J., HOYLAND J., FIELDING P. — Sequential dermal microvascular and perivascular changes in the development of scleroderma. J. Pathol ., 1992, 166 , 255-263.

[10] ROUMM A.D., WHITESIDE T.L., MEDSGER T.A. JR, RODNAN G.P. — Lymphocytes in the skin of patients with progressive systemic sclerosis. Arthritis Rheum., 1984, 27 , 645-653.

[11] DENTON C.P., SHI-WEN X., SUTTON A., ABRAHAM D.J., BLACK C.M., PEARSON J.D. — Scleroderma fibroblasts promote migration of mononuclear leucocytes across endothelial cell monolayers. Clin. Exp. Immunol ., 1998, 114 , 293-300.

[12] FARRELL A.J., BLAKE D.R. — Nitric oxide.

Ann. Rheum. Dis ., 1996, 55 , 7-20.

[13] KOLB H., KOLB-BACHOFEN V. — Nitric oxide in autoimmune disease : cytotoxic or regulatory mediator ? Immunol. Today , 1998, 19 , 556-561.

[14] DUGAS B., MOSSALAYI M.D., DAMAIS C., KOLB J.P. — Nitric oxide production by human monocytes : evidence for a role of CD23. Immunol. Today , 1995, 16 , 574-580.

[15] KANTOR T.V., FRIBERG D., MEDSGER T.A., BUCKINGHAM R.B., WHITESIDE T.L. — Cytokine production and serum levels in systemic sclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol ., 1992, 65 , 278-285.

[16] NEEDELMAN B.W., WIGLEY F.M., STAIR R.W. — Interleukin-1, interleukin-2, interleukin-4, interleukin-6, tumor necrosis factor α and interferon γ levels in sera from patients with scleroderma. Arthritis Rheum ., 1992, 35 , 67-72.

[17] ROSENBLOOM J., FELDMAN G., FREUNLICH B., JIMENEZ S.A. — Inhibition of excessive scleroderma fibroblast collagen production by recombinant γ interferon. Association with a coordinate decrease in types I and III procollagen messenger RNA levels. Arthritis Rheum ., 1986, 29 , 851-856.

[18] Subcommittee for Scleroderma Criteria of The American Rheumatism Association. Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee. — Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis Rheum ., 1980, 23 , 581-590.

[19] LEROY E.C., BLACK C., FLEISCHMAJER R., JABLONSKA S., KRIEG T., MEDSGER T.A. JR, ROWELL N., WOLLHEIM F. — Scleroderma (systemic sclerosis) : classification, subsets and pathogenesis.

J. Rheumatol ., 1988, 15 , 202-205.

[20] SAINT-CLAIR E.W., WILKINSON W.E., LANG T., SANDERS L., MISUKONIS M.A., GILKESON G.S., PISETSKY D.S., GRANGER D.L., WEINBERG J.B. — Increased expression of blood mononuclear cell nitric oxide synthase type 2 in rheumatoid arthritis patients. J. Exp. Med ., 1996, 184 , 1173-1178.

[21] ARNETT F.C., EDWORTHY S.M., BLOCH D.A., MCSHANE D.J., FRIES J.F., COOPER N.S., HEALEY L.A., KAPLAN S.R., LIANG M.H., LUTHRA H.S. et al . — The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.

Arthritis Rheum ., 1988, 31 , 315-324.

[22] GREEN L.C., WAGNER D.A., GLOGOWSKI J., SKIPPER P.L., WISHNOK J.S ., TANNENBAUM S.RR.

— Analysis of nitrate, nitrite, and (15N)nitrate in biological fluids. Anal. Biochem ., 1982, 126 , 131-138.

[23] CARTER L., SWAIN S.L. — Single cell analysis of cytokine production . Curr. Opin. Immunol. , 1997, 9 , 177-182.

[24] GRABOWSKI P.S., ENGLAND A.J., DYKHUIZEN R., COPLAND M., BENJAMIN N., RELD D.M., RALSTON S.H. — Elevated nitric oxide production in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum ., 1996, 39 , 643-647.

[25] HILLIQUIN P., BORDERIE D., HERNVANN A., MENKÈS C.J., EKINDJIAN O.G. — Nitric oxide as S-nitrosoproteins in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum ., 1997, 40 , 1512-1517.

[26] AEBERHARD E.E., HENDERSON S.A., ARABOLOS N.S., GRISCAVAGE J.M., CASTRO F.E., BARRETT C.T. — Nonsteroidal anti-inflammatory drugs inhibit expression of the inducible nitric oxide synthase gene. Biochem. Biophys. Res. Commun ., 1995, 208 , 1053-1059.

[27] OMATA T., SEGAWA Y., INOUE N., TSUZUIKE N., ITOKAZU Y., TAMAKI H. — Methotrexate suppresses nitric oxide production ex vivo in macrophages from rats with adjuvant-induced arthritis . Res. Exp. Med ., 1997, 197 , 81-90.

[28] SZABO C., MITCHELL J.A., GROSS S.S., THIEMERMANN C., VANE J.R. — Nifedipine inhibits the induction of nitric oxide synthase by bacterial lipopolysaccharride. J. Pharmacol. Exp. Ther ., 1993, 265 , 674-680.

[29] ZHANG X., HINTZE T.H. — Amlodipine releases nitric oxide from canine coronary microvessels .

Circulation, 1998, 97 , 576-580.

[30] KAHALEH M.B., PAN-SHENG F., MATUCCI-CERENIC M., STEFANOVIC-RACIC M., IGNARRO L. — Study of endothelial dependent relaxation in scleroderma. Arthritis Rheum ., 1993, 36 , S, 180.

[31] YAMAMOTO T., KATAYAMA I., NISHIOKA K. — Nitric oxide production and inducible nitric oxide synthase expression in systemic scleroderma. J. Rheumatol., 1998, 25 , 314-317.

[32] UEKI Y., MIYAKE S., TOMINAGA Y., EGUCHI K. — Increased nitric oxide levels in patients with rheumatoid arthritis. J. Rheumatol ., 1996, 23, 230-236.

[33] BENJAMIN N., VALLANCE P. — Plasma nitrite as a marker of nitric oxide production.

Lancet , 1994, 344 , 960.

[34] KAHALEH M.B., PAN-SHENG F. — Down regulation of nitric oxide synthase in microvascular endothelial cells from lesional scleroderma : assessment by quantitative RT-PCR and possible role for cytotoxic T-cells. Arthritis Rheum ., 1998, 41 , S, 277.

[35] ORMAN K.L., SHENEP J.L., ENGLISH B.K. — Pneumococci stimulate the production of the inducible nitric oxide synthase and nitric oxide by murine macrophages. J. Infec. Dis. , 1998, 6 , 1649-1657.

[36] WEINBERG J.B., MISUKONIS M.A., SHAMI P.J., MASON S.N., SAUIS D.L., DITTMAN W.A., WOOD E.R., SMITH G.K., MCDONALD B., BACHUS K.E., et al. — Human mononuclear phagocyte inducible nitric oxide synthase (iNOS) : analysis of iNOS mRNA, iNOS protein, biopterin, and nitric oxide production by blood monocytes and peritoneal macrophages. Blood , 1995, 86 , 1184-1195.

[37] ARIAS M., ZABALETA J., RODRIGUEZ J.L., ROJAS M., PARIS S.C., GARCIA L.F. — Failure to induce nitric oxide production by human monocyte-derived macrophages. Manipulation of biochemical pathways. Allergol. Immunopathol ., 1997, 6 , 280-288.

[38] MACMICKING J., XIE Q.W., NATHAN C. — Nitric oxide and macrophage function.

Ann. Rev.

Immunol ., 1997, 15 , 323-350.

[39] YAMAMOTO T., SAWADA Y., KATAYAMA Y., NISHIOKA K. — Increased production of nitric oxide stimulated by interleukin-1β in peripheral blood mononuclear cells in patients with systemic sclerosis. Br. J. Rheumatol. , 1998, 37 , 1123-1125.

[40] CAVALLO G., SABADINI L., ROLLO L., CATENACCIO M., LORENZINI S., PIPITONE N., MARCOLONGO R. — Nitric oxide synthesis in peripheral blood mononuclear and polymorphonuclear cells from patients with systemic sclerosis. Rheumatology , 1999, 38 , 1301-1304.

[41] COTTON S.A., HERRICK A.L., JAYSON M.I., FREEMONT A.J. — Endothelial expression of nitric oxide synthases and nitrotyrosine in systemic sclerosis skin . J. Pathol. , 1999, 189 , 273-278.

[42] FREEDMAN R.R., GIRGIS R., MAYES M.D. — Acute effect of nitric oxide on Raynaud’s phenomenon in scleroderma. Lancet , 1999, 354 , 739.

[43] KAHAN A., AMOR B., MENKÈS C.J. — Nicardipine in the treatment of Raynaud’s phenomenon.

Arthritis Rheum ., 1987, 30 , S, 62.

[44] KAHAN A., DEVAUX J.Y., AMOR B., MENKES C.J., WEBER S., VENOT A., GUERIN F., DEGEORGES M., ROUCAYROL J.C. — Nicardipine improves myocardial perfusion in systemic sclerosis. J.

Rheumatol ., 1988, 15 , 1395-1400.

[45] DHEIN S., ZHAO Y., SIMSEK S., SALAMEH A., KLAUS W. — Actions of 1,4-dihydropyridines in isolated mesenteric vascular beds. J. Cardiovasc. Pharmacol. , 1995, 26 , 784-791.

[46] VARGA G. — Progress in systemic sclerosis : novel therapeutic paradigms.

Current rheumatol

Reports, 2000, 2 , 481-485.

DISCUSSION

M. Michel BOUREL

Les sclérodermies en étude avaient-elles des signes vasculaires périphériques (Raynaud, lésions capillaroscopiques…) ? Comment comprendre le groupe « sciatique… » comme témoin ou groupe spécifique et représentatif ? La constatation d’un déficit ou d’un paramè- tre biologique permet-elle d’inférer un excès de l’antagoniste physiologique (vasodilatateurvasoconstricteur) ?

Tous les malades avaient un syndrome de Raynaud avec, pour deux d’entre eux, des signes de vascularite. La capillaroscopie n’a pas été faite. Le groupe sciatique a été choisi comme groupe témoin de maladie non inflammatoire par opposition à la polyarthrite rhumatoïde où nous avons mis en évidence une augmentation de l’expression du N0. Une publication récente du Lancet montre que la perfusion d’un donneur de N0, permet de corriger le syndrome de Raynaud induit.

M. Jean CIVATTE

Les phénomènes pathologiques décrits traduisant le spasme vasculaire correspondent-ils aussi aux attestations vasculaires observées en capillaroscopie sur le lit de l’ongle à type de mégacapillaires ? Un processus analogue peut-il être invoqué dans les formes cutanées soit pures mais étendues soit, surtout, monoméliques où l’atteinte cutanée est sous-jacente, une atteinte musculaire grave car scléro-atrophiante définitive ?

Le spasme vasculaire n’a pas été corrélé, dans notre étude, à l’existence de mégacapillaires. Un processus analogue peut être envisagé, en effet, pour certaines formes cutanées pures ou monoméliques, mais il n’est pas actuellement démontré.

M. Raymond ARDAILLOU

Vous avez montré une diminution de la production du NO et un retard à l’induction de la NO synthase des monocytes circulants chez les malades atteins de sclérodermie. La NO synthase inductible intervient en pathologie de manière générale par une production de NO accrue. Lorsque l’on recherche une diminution de la production de NO, ne faut-il pas plutôt explorer la NO synthase constitutive endothéliale ?

Il a été récemment rapporté par une équipe de Stanford, aux États-Unis, que la N0 synthase constitutive endothéliale est diminuée dans la sclérodermie.

M. Jacques CAEN

Quelles sont les cellules endothéliales testées ? Sont-elles représentatives des lésions capillaires ou artérielles ? Avez-vous pu utiliser les cellules endothéliales et les monocytes pour tester l’expression du facteur tissulaire ?

Les cellules endothéliales étudiées provenaient de la microcirculation dermique. Pour des raisons techniques, nous nous sommes limités à l’étude des monocytes.

M. François-Bernard MICHEL

Parmi les perspectives thérapeutiques, vous avez évoqué le monoxyde d’azote. C’est une voie d’accès très facile. A-t-elle été étudiée ? Ne pensez-vous pas qu’il s’agirait d’un traitement purement symptomatique ?

Il est théoriquement possible que l’application précoce d’un traitement par le monoxyde d’azote puisse limiter l’extension de la maladie.

M. Claude MOLINA

Les sclérodermies que vous avez étudiées comportaient-elles des localisations pulmonaires importantes, à type d’hypertension artérielle pulmonaire. Ce qui pourrait confirmer l’hypothèse de la vasoconstriction et déboucher sur l’essai thérapeutique de nouvelles molécules (par exemple dérivés du Viagra dans l’HTA pulmonaire) ?

Nos malades avaient presque tous une fibrose pulmonaire interstitielle mais sans hypertension artérielle pulmonaire.

M. Georges SERRATRICE

Quelles conséquences thérapeutiques pourraient résulter de vos travaux dans cette maladie jusqu’ici particulièrement rebelle aux traitements ?

En dehors de l’utilisation de donneurs de monoxyde d’azote à un stade relativement précoce de la maladie, les derniers traitements proposés portent sur les relations entre T-lymphocytes et cellules endothéliales. Mme Carol Black, de Grande Bretagne, a proposé de traiter les formes systémiques sévères par l’association de globulines anti-Tlymphocytes et de mycophénolate mofetil. Il existe, également, un protocole en cours de traitement des formes graves par autogreffe de cellules souches.


* Service de Rhumatologie A. ** Laboratoire de Biochimie A, Hôpital Cochin, 27 rue du Faubourg Saint-Jacques — 75679 Paris cedex 14. Tél : 01 58 41 25 71. Télécopie : 01 43 25 87 23. Tirés-à-part : Professeur Charles-Joël MENKÈS, à l’adresse ci-dessus. Article reçu le 20 décembre 2000, accepté le 8 janvier 2001.

Bull. Acad. Natle Méd., 2001, 185, no 3, 509-523, séance du 6 mars 2001