INTRODUCTION

Les cancers du sein sans métastase ganglionnaire au moment du diagnostic précoce, ont une incidence actuellement considérablement accrue du fait des programmes de dépistage dans les pays occidentaux. Ces cas sont de bon pronostic à dix ans puisqu’un traitement loco-régional seul permet d’avoir une survie de 70 % à dix ans.

Cependant, 30 % des malades vont récidiver [1] et de fait, une chimiothérapie est proposée à toutes ces patientes alors qu’elles sont dépourvues de métastase ganglionnaire [2, 3]. La conséquence de ce traitement qui a pour but de limiter les récidives et le développement des métastases, a l’inconvénient aussi de surtraiter la majorité des patientes avec toutes les conséquences délétères (d’effets secondaires et de toxicité) de ces traitements agressifs par ailleurs très coûteux. À cet égard, les développements récents de la biologie moléculaire ont eu pour but d’identifier et de reclasser les cancers du sein en fonction de leur expression génomique, et tout particulièrement les cancers du sein débutants sans métastase ganglionnaire au moment du diagnostic premier [10, 12, 13].

Cependant, ces méthodes d’évaluation sont difficiles à mettre en œuvre [4-11] puisqu’elles nécessitent le plus souvent des fragments tissulaires congelés pas toujours faciles à obtenir en pratique diagnostique courante, ou des tissus brièvement fixés dans des fixateurs non formolés différents de ceux utilisés pour le diagnostic histopathologique avant congélation. D’autre part, elles nécessitent une quantité non négligeable de tissu, ce qui peut poser problème dans le cas de ces tumeurs débutantes de petite taille, et porter préjudice au diagnostic positif même des tumeurs par insuffisance de résidu tumoral (archives tissulaires légales) après pré- lèvements spécifiques pour puces génomiques. Enfin elles sont très coûteuses aussi bien à l’échelon individuel qu’en terme de santé publique. Par ailleurs, l’importance des données fournies par les études en biologie moléculaire sont souvent très difficiles à gérer en biostatistique et les résultats sont souvent critiqués, voire sujets à caution [14-16].

Les récents développements en immunohistochimie au contraire, montrent qu’avec un coût très réduit (au moins dix fois moindre), l’identification des protéines intra tissulaires, est beaucoup plus facile à réaliser puisque les tests immunohistochimiques sont faisables sur tissu fixé (le même que celui utilisé pour le diagnostic courant) et demandent de très faibles quantités de tissus puisque seulement une coupe de 4 microns d’épaisseur par anticorps est nécessaire. Les tests immunohistochimiques néanmoins sont souvent critiqués par le mode d’évaluation aléatoire des résultats qui est le plus souvent effectué sur un mode semi-quantitatif par des observateurs, et non pas par une évaluation quantitative standardisée par automate.

Le développement d’analyseurs d’images, permettant de mesurer quantitativement les réactions immunohistochimiques sur images microscopiques numérisées après tests immunohistochimiques [17-21], permet de pallier cet inconvénient et d’atteindre une standardisation optimale, associée à une automatisation, particulièrement intéressante en pratique diagnostique [22-41] (contrôles de qualité possibles).

Dans l’étude présente, notre objectif était de déterminer une signature immunohistochimique de mauvais pronostic dans les cancers du sein débutants sans métastase ganglionnaire. Nous nous sommes penchés essentiellement sur l’identification d’un risque métastatique par une méthode économiquement acceptable en terme de santé de publique. Nous avons ainsi évalué 37 marqueurs sur 586 tumeurs dont l’expression quantitative a été corrélée à l’évolution clinique des patients, individuellement et associés dans une « signature » performante. La sélection des marqueurs n’a pas été exhaustive mais a porté sur un échantillonnage de protéines incluses dans les processus de croissance cellulaire, de prolifération, d’invasion et de diffusion dans la matrice extracellulaire, de néoangiogénèse ainsi que dans les différentes principales voies de signalisation, selon les données de la littérature. Cette sélection sera sans doute amenée à évoluer dans le temps avec incrémentation de nouveaux marqueurs qui peuvent apparaître pertinents.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Patients

Une série de 667 malades porteuses d’adénocarcinome du sein invasif, opérées de 1995 à 2000 dans le même service d’oncologie gynécologique de l’Hôpital de la Conception à Marseille, ont été sélectionnées pour avoir un recul suffisant de 86 mois en moyenne. Toutes les malades de la série ont eu un traitement chirurgical de première intention géré par la même équipe chirurgicale. La prise en charge de la pièce opératoire a été effectuée par le même groupe de trois pathologistes seniors (CTC, SG, LA). Le traitement conservateur et l’exérèse ganglionnaire (soit totale, soit évaluation du ganglion sentinelle) ont été indiqués en fonction des recommandations européennes (et ANAES) du moment. De même, la radiothérapie et la chimiothérapie, ainsi que l’hormonothérapie, ont été appliquées selon les protocoles recommandés et standardisés, les critères d’indication étant les mêmes pour toutes les patientes traitées par les mêmes équipes de chimiothérapeutes et de radiothérapeutes. Du fait de la difficulté à obtenir, sur puces tissulaires, des résultats homogènes pour les 37 marqueurs, la série pour laquelle les résultats ont été complets, s’est réduite en fin d’analyse, à 586 malades.

L’étude du suivi des patients à 86 mois montre que 87/586 malades avaient des métastases à distance. L’âge moyen des patients était de 57 ans (de 40 à 65 ans). Les tumeurs étaient classées de la façon suivante : pT1b (32 %), pT1c (68 %). Toutes les tumeurs étaient de type canalaire, invasives, sans autre sous-type spécifique et de grade 1 pour 29 %, de grade 2 pour 59 % et de grade 3 (grade de Ellis et Elston) pour 12 % des cas.

Notre étude étant essentiellement ciblée sur l’évaluation quantitative des tests immunohistochimiques sur micro-biopsies (ou puces tissulaires) avec corrélation à l’évolution clinique, les détails histologiques et autres critères pronostiques n’ont pas été pris en considération afin de limiter la quantité de données à traiter d’une part, l’évaluation pronostique de ces différents paramètres histopronostiques sur colorations standards ayant été déjà depuis longtemps publiée d’autre part.

Matériel tissulaire

Les fragments tissulaires utilisés pour les micro-biopsies (ou puces tissulaires « tissue micro-array » / TMA) ont tous eu pour source des pièces opératoires fixées au formol. Dans tous les cas, du fait des habitudes de gestion des prélèvements contrôlés dans le service de pathologie, et au cours des examens extemporanés, faits systématiquement à cette époque, les pièces opératoires ont été rapidement, après exérèse, mises à fixer très rapidement dans du formol tamponné par les pathologistes eux-mêmes. Les fragments tumoraux prélevés ont le plus souvent inclus la totalité des tumeurs permettant une réserve significative et disponible pour tests diagnostiques ultérieurs. La durée de fixation a été de 24 heures pour les exérèses de plus petite taille, inférieures à 5 cm, et 48 heures pour les exérèses plus larges, afin de favoriser la pénétration du formol après dissection de la pièce opératoire à température ambiante et éviter les phénomènes de lyse tissulaire. Après fixation, l’inclusion en paraffine a été effectuée pour tous les prélèvements dans des automates de la même marque, avec les mêmes programmes. Enfin, les blocs de paraffine ont été stockés à partir de 1995 dans la même salle d’archives dont la température a été maintenue et contrôlée à 20° C, permettant d’avoir une préservation homogène des protéines tissulaires dans toute la série.

Technique immunohistochimique

Les 37 coupes sériées ont été effectuées de façon séquentielle sur chacun des blocs permettant de tester chacun des marqueurs en immunoperoxydase selon la technique décrite dans nos précédentes publications [22-28, 41-43, 45, 46]. Le test immunohistochimique a été réalisé sur automate Ventana Benchmark XT dans les mêmes conditions de régénération d’antigènes pour toutes les tumeurs et toutes les coupes.

Tous les anticorps utilisés sont des anticorps commercialisés et documentés (Tableau 1) et publiés.

Construction des puces tissulaires ou blocs de micro-biopsies

Les puces tissulaires ont été effectuées par micro-biopsies de blocs de paraffine selon une technique décrite dans la littérature au cours de la dernière décade et entre nos mains depuis six ans [22, 27, 40]. Cette méthode consiste à prélever des microbiopsies de 0,6 mm de diamètre dans les blocs de paraffine, de les réinclure dans des blocs secondaires de paraffine juxtaposées les unes aux autres et dont l’identité est repérée par un programme informatique propre au système utilisé. Ceci a permis d’inclure dans un même bloc des centaines de tumeurs. Dans la présente étude, trois nouveaux blocs ont été ainsi constitués avec deux micro-biopsies ou « carottes » par patients, soit environ 220 cas par bloc (contenant 440 « carottes »). Les nouveaux blocs constitués (ou puces tissulaires ou blocs de microbiopsies multiples) ont été stockés à 4° C avant que les coupes de 4 microns de chacun des blocs soient effectuées par microtome automatisé pour la mise en œuvre de la technique immunohistochimique.

Analyses d’images

La densitométrie des précipités immunohistochimiques dans chacune des biopsies a été effectuée après numérisation des images microscopiques, avec un système d’analyse d’images SAMBA 2050 (SAMBA Technologies, Meylan/Grenoble, France) selon la méthode précédemment rapportée [27, 28, 40].

Tableau 1. — Liste en provenance des anticorps utilisés (immunoperoxydase automatisée / Ventana Benchmark XT) dans les micro-biopsies (0,6 mm) des ‘‘ puces tissulaires ’’ (420 micro-biopsies par lame) dans la série étudiée (n = 586) de cancers du sein.

ANTICORPS

SOCIÉTÉ

SOURCE*

CLONES 1 Récepteurs Oestrogènes Ventana Mmab 6F11 2 Récepteurs Progestérone Ventana Mmab 1E2 3 c-erbB2 Novocastra Mmab CB11 4 P16 Neomarkers Mmab Ab7(16PO7) 5 P53 Dako Mmab DO-7 6 Bcl2 Dako Mmab 124 7 CD 146 Novocastra Mmab N1238 8 Caveolin 1 Santa Cruz Rpab 9 c-Met Chemicon/Abcys Mmab 4AT44 10 JAK 1 Cell Signaling Rpab 11 PI3 kinase Cell Signaling Rpab 12 PTEN Cell Signaling Mmab 26H9 13 Cytokeratins 5-6 Dako Mmab D5/16B4 14 CD 117 (c-Kit) Dako Rpab 15 CA IX Abcam Rpab 16 FYN Abcam Mmab 1S 17 SHARP 2 Abcam Rpab 18 P21Waf1-Cip1 Cell Signaling Mmab DCS60 19 P27 Kip1 Cell Signaling Rpab 20 P38 MAP kinase Cell Signaling Rpab 21 FAK Cell Signaling Rpab 22 STAT-1 Cell Signaling Mmab 9H2 23 EGFR Ventana Mmab 3C6 24 Phospho-MAPKAPK-2 Cell Signaling Rmab (Thr334) 25 Cytokeratin 19 Dako Mmab BA17 26 CD 34 Dako Mmab QBEnd-10 27 CD 10 Novocastra Mmab 56C6 28 STAT- 3 Cell Signaling Rmab Tyr 705 D3A7 29 Cytokeratin 14 Novocastra Mmab LL002 30 Cytokeratin 17 Dako Mmab E3 31 Cytokeratins 8 & 18 Zymed Mmab Zym5,2(UCD/PR-10,11) 32 Moesinr 1 Biomeda Mmab 38/87 33 CD 44v6 Novocastra Mmab VFF-7 34 Ezrine (p81, 80k, cytovillin) Neomarkers Mmab 3C12 35 P-Cadherine Novocastra Mmab 56C1 36 Maspine BD Pharmingen Mmab G167-70 37 FGFR-1 Flg (C-15) Santa Cruz Rpab * Mmab, anticorps monoclonal de souris ; Rpab, Anticorps polyclonal de lapin.

Analyses statistiques

Les biostatistiques ont été effectuées avec des logiciels documentés et commercialement disponibles, NSCC et Statistica. Les corrélations de l’expression immunohistochimique, aux survies avec ou sans métastases des patients ont été effectuées par tests monofactoriels (études univariées / Log rank / courbes de Kaplan Meier). Le seuil de signification pronostique pour chacun des marqueurs a été déterminé selon les méthodes précédemment rapportées [22-28, 40], et recommandées [44]. L’évaluation multifactorielle a été effectuée en régression logistique avec établissement des courbes de ROC et détermination des sensibilités et spécificités de chacun des assemblages de marqueurs proposés.

RÉSULTATS

L’expression immunohistochimique pour chacun des 37 marqueurs a été comparée entre les patientes présentant des métastases (n = 97) et celles ne présentant pas de métastase à distance (n = 489). L’immunomarquage moyen de ces deux catégories s’est révélé très significativement différent. L’évaluation quantitative densitomé- trique de chacun des marqueurs a ensuite été évaluée en fonction de l’apparition ou non de métastases en analyse univariée, montrant que 29/37 marqueurs présentaient une signification pronostique en terme d’apparition de métastases (suivi moyen de 86 mois) (Tableau 2). Une étude multivariée en régression logistique avec établissement des courbes de ROC ont été effectués à la recherche du regroupement de marqueurs les plus performants qui associés, permettent de déterminer au mieux le risque d’apparition de métastases. Cette approche a permis de montrer que 15 marqueurs sur les 29, individuellement significatifs en terme de prédiction d’apparition de métastases, permettaient de classer correctement les patients dans les groupes avec métastases et sans métastase dans 82,7 % des cas (Tableau 3).

Lorsque les 29 marqueurs sont pris tous ensemble, la performance de classement est un peu meilleure avec 84,8 % de malades bien classés. Parallèlement, si les récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone et l’expression du Cerb B2 ne sont pas considérés dans le groupe des 29 (groupe restreint à 26 marqueurs), les malades se trouvent classés de façon pratiquement similaire avec 83,6 % de bien classés. Ceci montre que la signature protéomique identifiée est bien indépendante du statut hormonal et de l’amplification de l’oncogène HER-2 neu.

Lorsque les 25 marqueurs sont évalués dans une première étape de la régression logistique avec 84,8 % de patients bien classés, la sensibilité du test est de 85,5 % et la spécificité de 84,6 % (Figure 3 ROC 1er niveau). À l’issue de cette première étape de la régression, 15 marqueurs restent significativement prédictifs de l’apparition de métastases (signature de 15 marqueurs) (Tableau 3) et correspondent aux marqueurs suivants : CD34, CA IX, FGFR1, c-Kit, Bcl2, P16, P27, P21, P53, P38, JAK,

Tableau 2. — Corrélation entre le niveau d’expression immunohistochimique moyen (densitométrie par analyse d’images microscopiques numérisée) de 37 marqueurs dans 586 cancers du sein (sans métastase ganglionnaire) dans les sous-groupes ayant ou n’ayant pas de métastase ganglionnaire (recul moyen 86 mois).

Analyse d’images (densitométrie)

Marqueurs tissulaires

Score quantitative de la positivité (immunohistochimie) immunohistochimique

Test de Mann-Whitney

Nombre de tumeurs

Valeur moyenne

Types de marqueurs p

Valeur moyenne positives (sans métastases) (avec métastases)

Prolifération cellulaire 1 P53 321/586 < 0.0001 1.4 25.2 2 P16 210/586 < 0.01 7.1 16.4 3 P21 151/586 < 0.001 3.9 11.8 4 PTEN 320/586 0.001 6.4 2.5 5 Maspin 390/586 < 0.001 8.9 16.4 6 Bcl2 70/586 < 0.01 2.8 11.3 7 P27 97/586 < 0.01 3.7 7.2 Angiogenesis 8 CD 146 280/586 0.021 0.9 2.8 9 CD 34 0.03 2.9 5.8 10 CA IX 58/586 < 0.0001 2.3 7.1 Invasion Adhésion métastases 11

C-Met 210/586 < 0.001 12.3 26.9 12 CD 44v6 90/586 0.0001 2.6 31.8 13 FAK 102/586 0.0001 1.5 3.1 14 Moesin 20/586 0.001 12.5 27.7 15 Ezrin 410/586 < 0.0001 1.9 5.1 16 P-Cadherin 80/586 < 0.0001 16.9 36.6 Croissance tumorale 17 c-erb B2 11/586 < 0.0001 12.4 32.6 18 EGFR 42/586 < 0.001 7.9 13.1 19 c-kit 94/586 < 0.0001 3.5 8.9 20 FGFR 90/586 0.005 23.2 38.6 Voies de signalisation 21

P38 MAPK 72/586 0.0014 2.3 4.5 22 P13K 212/586 < 0.001 15.7 28.9 23 pMAP-K 125/586 < 0.001 12.7 17.6 24 pSTAT-3 120/586 0.0063 3.1 6.4 25 STAT-1 76/586 < 0.0001 4.5 9.7 26 FYN 423/586 < 0.01 9.3 14.9 27 JAK 77/586 0.0036 1.5 4.4 28 SHARP-2 429/586 0.004 6.5 8.8 Sous-types de cellules carcinomateuses 29

CK 5, 6 103/586 < 0.0001 3.4 7.1 30 CK 14 112/586 < 0.01 1.3 6.9 31 CK 17 80/586 0.03 1.6 8.2 32 CK 8, 18 198/586 0.0023 17.4 11.5 33 CK 19 303/586 < 0.0001 5.3 0.6 34 CD 10 535/586 0.0046 1.1 2.1 35 Caveolin-1 20/586 < 0.00001 9 24.3 36 Réc. Oestrogènes 446/586 < 0.00001 42.3 8.1 37 Réc.Progestérone 383/586 < 0.00001 36.1 6.2

Tableau 3. — Régression logistique des niveaux d’expression (densitométrie par analyse d’images) de 29 marqueurs (sur 37) ayant individuellement une valeur pronostique prédictive de l’apparition de métastases, dans les cancers du sein débutants sans métastase ganglionnaire au moment du diagnostic (n = 586) : 15 marqueurs restent significatifs après la régression multiple (ROC), bien classés 84,6 %.

Marqueurs p immunohistochimiques (régression multiple) 1 Bcl2 0.0381 2 CA IX 0.0081 3 Caveolin 0.9511 4 CD 10 0.3777 5 CD 34 0.0191 6 CD 44v6 0.6888 7 c-erb 2 0.345 8 CK 19 0.014 9 c-kit 0.0145 10 EGFR 0.1636 11 Ezrin 0.5174 12 FAK 0.4577 13 FgFR1 0.0001 14 JAK 0.0061 15 CK 5-6 0.495 16 CK 8-18 0.0555 17 CK 14 0.6195 18 CK 17 0.1199 19 Moesin 0.0543 20 P16 0.0002 21 P21 < 0.0001 22 P27 < 0.0001 23 P38 0.0037 24 P53 < 0.0001 25 PMAPK 01433 26 pSTAT3 0.0017 27 ER 0.0001 28 STAT1 < 0.0001 29 PR 0.057 STAT1, STAT3, CK19 et RE. Lorsque les 26 marqueurs sont considérés, les 15 marqueurs significatifs restants sont les mêmes avec la CK8-18 remplaçant les récepteurs aux oestrogènes.

La Fig. 1 montre le dendrogramme d’expression des 25 marqueurs dans les 586 tumeurs étudiées (distribution hiérarchique supervisée).

Fig. 1. — Dendrogramme (« cluster »), de l’expression immunohistochimique des 25 marqueurs testés dans la série de 586 cancers du sein (dépourvus de métastases ganglionnaires) ayant une valeur pronostique individuelle (en Log Rang test), montrant la distribution des marqueurs et leur relation (association / proximité) dans la population étudiée (étude hiérarchisée supervisée).

DISCUSSION

L’étude quantitative immunohistochimique de chacun des marqueurs a permis dans un premier temps de déterminer le seuil de signification pronostique en terme d’apparition des métastases dans une série de 586 cancers du sein chez des patientes ne présentant pas de métastase ganglionnaire au moment du diagnostic. Dans un deuxième temps, l’étude en régression multiple a permis de déterminer la meilleure association des marqueurs pronostiques, permettant de classer correctement 83,6 % des patients dans les groupes avec ou sans métastases, après un suivi de 86 mois en moyenne. Cette association de marqueurs correspond à une signature spécifique indépendante du statut hormonal et de la surexpression de l’oncogène Cerb B2 / HER-2 neu et comprend CD34, CA IX, P53, P16, Bcl2, P21, P27, P38, STAT1, pSTAT3, JAK, CK19, CK8-18, c-Kit, FGFR1. Aucune étude portant sur l’évaluation immunohistochimique quantitative dans les cancers du sein sans métastase ganglionnaire n’a été jusqu’à présent publiée. Seulement de rares études portant sur quelques marqueurs ont fait l’objet d’une approche immunohistochimique quantitative [17-21].

La signature mise en évidence dans notre étude ne constitue qu’un résultat préliminaire et sera amenée à changer avec l’inclusion de nouveaux marqueurs devant être évalués selon la même procédure. En effet, le choix de nos anticorps a été basé comme dans la plupart des études [29], sur des données partiellement empiriques, à savoir la qualité, la disponibilité des anticorps et surtout la qualité du résultat après utilisation sur tissus fixés et inclus en paraffine, provenant d’archives tissulaires, ayant servi aux diagnostics histopathologiques premiers. Le choix a aussi été déterminé par les données de la littérature concernant la pertinence des marqueurs dans les cancers du sein, notamment à partir des résultats d’études de profil génomique [4-13] et d’études immunohistochimiques récentes [29-40].

L’expression immunohistochimique de Bcl2, P53, pSTAT3, JAK, P21 et P27 [23, 27, 28, 40, 46, 47] a été individuellement étudiée et publiée comme des marqueurs pronostiques dans le cancer du sein mais aucun n’a fait partie d’une étude regroupée en régression multiple (et dendrogrammes). De même, l’expression et l’amplification du gène FGF-R1 a été récemment évaluée dans les cancers du sein comme un marqueur pronostique indépendant en terme de survie et comme potentiel cible thérapeutique [48]. C-kit / CD117 a été étudié dans une autre série montrant une surexpression variable [38] et pourrait être une cible thérapeutique intéressante dans les cancers du sein, comme dans un certain nombre de tumeurs malignes solides beaucoup moins fréquentes (GIST).

La croissance tumorale est fortement liée à la néoangiogénèse et à l’activation des cellules endothéliales associées à une surexpression des marqueurs d’activité endothéliaux tels que le CD34/PECAM, le CD146 / Mel-CAM, le CD105 / Endoglin et la V-cadherine. Individuellement, ces marqueurs ont été évalués par technique immunohistochimique et notamment notre groupe a pu montrer l’association de la plupart d’entre eux avec une évolution péjorative dans les cancers du sein [27, 28, 40, 43, 45]. Il est donc peu surprenant que le CD34 fasse partie de la signature identifiée en régression multiple, apparemment plus sensible que les autres marqueurs de néoangiogénèse, notamment dans les cancers du sein N-. De même, l’angiogénèse du stroma tumoral est très sensible aux facteurs d’hypoxie par l’intermédiaire de HIF sécrété par les cellules tumorales et activant l’angiogénèse et la stimulation des cellules endothéliales, par l’intermédiaire de voies de signalisation particulières, notamment celles incluant CA IX [43, 44, 50]. Dans notre étude, effectivement, CA IX semble jouer un rôle important puisque sa surexpression est significativement associée à une évolution métastatique dans les cancers débutants, comme le CD34.

L’étude de HIF est en cours d’investigation dans notre série, mais la qualité des anticorps disponibles ne permet pas encore d’inclure HIF dans notre signature.

La plupart des études immunohistochimiques et génomiques ont été orientées sur l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, notamment pour les tumeurs dites « triple négatives » (RE, RP, HER-2 négatifs). De même, des études en biologie moléculaire ont identifié des signatures moléculaires de très mauvais pronostic qui sont proposées dans les tumeurs sans métastase ganglionnaire pour aider à l’éligibilité des patients à une chimiothérapie post-chirurgicale [10, 12, 13]. Il faut néan- moins souligner que les techniques immunohistochimiques effectuées sur les mêmes blocs utilisés pour le diagnostic microscopique précoce de cancer, sont beaucoup plus faciles et beaucoup moins coûteuses (plus de dix fois moins coûteuses) que les techniques lourdes en biologie moléculaire. Par ailleurs, ces tests immunohistochimiques peuvent être effectués dans des structures de laboratoire de pathologie, très rapidement en 24-48 heures, comme cela se fait pour l’identification des cibles thérapeutiques actuelles (récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone et surexpression de l’HER-2 neu). Coût, rapidité et très peu de matériel tissulaire nécessaire sont des atoûts majeurs par rapport aux techniques de génomique.

Néanmoins, les tests en immunohistochimie doivent être standardisés et calibrés comme tout test biologique avec transfert en pratique clinique. Or, la plupart des études immunohistochimiques sont jusqu’à présent effectuées en évaluation semiquantitative, faciles à faire et rapides mais manquant de précision et de reproductibilité. L’inclusion des signatures immunohistochimiques en pratique diagnostiques doit donc passer par un système de contrôle de qualité faisable grâce à la quantification des résultats immunohistochimiques automatisés par densitométrie utilisant analyse d’images microscopiques numérisées et des logiciels spécifiques et calibrés pour quantifier, comme les ELISA, la quantité d’immunoprécipités selon une échelle de valeurs arbitraires (255 à 0 niveaux de gris). Cette méthode permet d’obtenir des valeurs numériques continues très appropriées pour tout test immunohistochimique et surtout pour la détermination des seuils de positivité adéquats sur des cohortes importantes comme la nôtre (Tableau 2), par la corrélation du score numérique de marquage à l’évolution clinique (dans le cas présent, survie avec ou sans métastase). Les seuils de positivité sont ainsi contrôlables [44] et les valeurs peuvent être étudiées en dendrogrammes [29, 51].

CONCLUSION

Notre étude à haut débit sur micro-biopsies séquentielles sur lames de 0,6 mm (« puces tissulaires »), émanant de 586 tumeurs du sein (chez des patientes ne présentant aucune métastase ganglionnaire au moment du diagnostic primaire) par densitométrie sur images microscopiques numérisées associée à une évaluation statistique appropriée (Log rank test / régression logistique), nous a permis d’identifier une signature moléculaire de 15 marqueurs permettant de classer correctement individuellement les malades (avec une performance de 84,8 %, et 83,6 % indépendamment du statut hormonal et de la surexpression du Cerb B2) dans le groupe notamment des patientes ne présentant pas de risques métastatiques importants, et pour lesquelles la chimiothérapie adjuvante, souvent indiquée, peut être évitée ainsi que les effets secondaires délétères et les coûts inutiles qui en résultent.

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DISCUSSION

M. Jacques ROUE ı

SSE

Au début de votre communication vous avez parlé de 64 marqueurs et à la fin de 200 marqueurs. Combien en pratique, en utilisez-vous ? Votre programme PHRC consiste-t-il en une validation par d’autres équipes de la pertinence de votre approche et des marqueurs protéiques que vous utilisez ?

Pour notre étude, nous avons utilisé initialement près de deux cents marqueurs que nous avons pré-évalués sur coupes de tissu conventionnelles en comparant les résultats entre matériel congelé (fragments tissulaires conservés en tumorothèque) et fixé au formol puis inclus en paraffine (archives légales du diagnostic histologique). Les résultats en test de Log Rank/Kaplan Meier et en analyse d’images ne se sont révélés pertinents (bonne corrélation entre congélation/fixation) que pour soixante-quatre marqueurs. Les autres marqueurs, soit 136 mentionnés comme de valeur pronostique dans la littérature ne s’étant entre nos mains pas révélés comme tels, avec cette méthode. Notre étude sur TMA s’est basée sur 64 marqueurs testés sur plus de six cents tumeurs. Une signature de 10 marqueurs s’est révélée performante pour prévoir le pronostic en termes d’apparition de métastases à distance à dix ans, avec une exactitude de 91,6 %. Cette signature de dix marqueurs (soit donc sur 10 coupes séquentielles de 4 μm, soit 40 μm d’épaisseur de tissu) pourrait donc être utilisée en pratique diagnostique quotidienne. Comme je l’ai indiqué, notre étude nécessite une technique immunohistochimique standardisée, grâce à un appareillage spécifique (automate) et un système d’analyse d’images permettant de quantifier les résultats immunohistochimiques en termes de densitométrie selon des valeurs numériques quantitatives corrélables au suivi des patients. Le PHRC que nous nous proposerons de faire est, après l’obtention du brevete de cette signature qui vient d’être effective, de lancer une étude prospective pour d’une part, faire évaluer la méthodologie par d’autres Centres Hospitalo-Universitaires et Centres Anticancéreux, à l’échelon national, et d’autre part, de développer la commercialisation d’une trousse.

Donc, à terme, notre objectif est d’utiliser en pratique diagnostique de routine ces dix marqueurs ou anticorps pour détection immunohistochimique quantitative sur coupes de tissu à partir de blocs de paraffine ayant initialement servi un diagnostic de cancer du sein sur prélèvements fixés et enrobés en paraffine. Ceci nous permet de mieux sélectionner les patientes dépourvues de métastase ganglionnaire au temps diagnostique pour les indications des thérapeutiques post-chirurgicales, notamment les chimiothérapies néoadjuvantes. On sait en effet qu’approximativement et théoriquement, 70 % des patientes sans métastase ganglionnaire ne nécessitent pas des traitements agressifs qui sont délé- tères à titre individuel et fort coûteux et en termes de santé publique.

M. François-Bernard MICHEL

Cet outil de pronostic et de stratégie est-il du domaine de la recherche, ou bien est-il disponible dans plusieurs CHU ? Vos thérapeutes en déduisent-ils leur stratégie thérapeutique (abstention éventuelle) ?

En l’absence de validation à l’échelon national, voire international, il n’est pas possible à l’heure actuelle d’utiliser en pratique courante cette signature protéomique intratissulaire. Néanmoins, l’objectif d’un tel projet d’étude est de pouvoir transférer les résultats de cette recherche à la pratique diagnostique sous réserve d’une part de la validation multicentrique, d’autre part d’une commercialisation. Actuellement, de telles trousses diagnostiques concernant des tests en biologie moléculaire sont commercialisées aux États-Unis et dans certains pays d’Europe, à hauteur de 5 000 $ par patients sélectionner (surtout dans le contexte des tumeurs dépourvues de métastase ganglionnaire), au moment du diagnostic histologique initial, les patientes nécessitant des traitements plus agressifs que d’autres, en post-chirurgical. L’immunohistochimie étant peu coûteuse par rapport à la biologie moléculaire, et beaucoup plus facile à gérer sur le plan pratique, ne nécessitant que 40 μm d’épaisseur de tissu fixé et archivé, elle est beaucoup plus facile à gérer que la biologie moléculaire qui nécessite du tissu congelé et qui sont vouées à l’échec (retard de transmission, etc.), en routine. Notre objectif est que cette signature soit associée aux algorithmes de décision thérapeutique disponibles en ligne qui prendront en compte bien sûr tous les autres paramètres concernant les patients (contexte familial, cofacteurs divers, grades histopronostiques) indépendamment de l’absence de métastase ganglionnaire et de petite taille tumorale.

M. Roger HENRION

L’utilisation des marqueurs immunohistochimiques pourrait-elle aboutir à terme à l’abandon de l’exérèse des lymphatiques dans le traitement des cancers du sein ?

Non, car il est clair que cette approche immunohistochimique ne peut interférer dans le cadre des indications de l’évidement ganglionnaire axillaire qui accompagne le traitement chirurgical de tout carcinome invasif, adénocarcinomes du sein inclus. Par contre, si notre travail est particulièrement intéressant dans les tumeurs sans métastase ganglionnaire, nous avons identifié d’autres signatures aussi pertinentes qui pourront aider à décider de la nature et de l’importance de la chimiothérapie postopératoire dans les cas de tumeur invasive avec métastase ganglionnaire au moment du diagnostic. Ces signatures peuvent en effet aider à moduler la thérapeutique, mais aussi au développement de nouvelles thérapeutiques ciblées.

Bull. Acad. Natle Méd., 2009, 193, no 9, 2045-2061, séance du 8 décembre 2009