INTRODUCTION

L’endomètre est une muqueuse composée principalement de structures glandulaires et stromales, répondant aux stimulations hormonales, entre autres œstrogéniques et progestatives. En pathologie, l’évaluation morphologique (ou histopathologique) de l’endomètre s’effectue dans des contextes cliniques différents, notamment d’âges, se traduisant néanmoins par des signes communs : excès de prolifération traduite par une pluristratification et la présence de mitoses, avec ou sans sécrétion associée traduite par la présence de vacuoles de glycogène dans les cellules épithéliales. Ces
données morphologiques s’intègrent dans le cadre d’anomalies fonctionnelles ou pré-néoplasiques. La période de la ménopause est particulièrement visée par la surveillance d’une prolifération pouvant devenir incontrôlée, sans réponse aux progestatifs et insuffisamment maîtrisée dans le cadre d’un traitement hormonal substitutif de la ménopause. Ces données se situent dans un contexte de santé publique majeur puisqu’il concerne quasiment toutes les femmes.

L’étude fonctionnelle d’endomètre humain par l’intermédiaire du modèle de culture d’explants présente l’avantage majeur de la préservation des structures tissulaires, notamment les connections entre cellules épithéliales glandulaires, cellules stromales et cellules endothéliales. Le modèle de culture a été développé au cours d’une étude préliminaire [1] permettant de définir les conditions optimales de culture d’une part, et les paramètres les plus accessibles dont les variations lors des stimulations hormonales, par comparaison avec les explants témoins (cultures avant stimulation) sont mesurables et pertinentes. Dans cette optique, nous avons testé différents échantillons d’endomètres prolifératifs classés selon des critères histologiques classiques en endomètres homogènes prolifératifs et également en endomè- tres hétérogènes prolifératifs lorsqu’une composante sécrétoire coexiste avec une composante proliférative prédominante [1]. Les endomètres hétérogènes à prédominance proliférative sont fréquemment observés en diagnostic chez les femmes à la périménopause [2, 3] ; et dans une étude précédente [1] nous avons montré qu’ils présentent les mêmes profils d’immunomarquage en RE et RP que les endomètres homogènes prolifératifs.

L’action proliférative des œstrogènes sur l’endomètre humain [4] et l’action antiœstrogénique des progestatifs, notamment l’action anti-proliférative sont bien connues [5]. Néanmoins, la réactivité in vivo de l’endomètre humain aux progestatifs de synthèse est variable. Les cliniciens sont confrontés à différents problèmes d’adaptation du traitement instauré nécessitant une surveillance de l’endomètre.

C’est pourquoi, l’évaluation de la réponse de l’endomètre aux différents progestatifs sur des modèles de culture tissulaire d’endomètre humain, est très intéressante. La réponse de l’endomètre à la stimulation par des progestatifs peut être évaluée par mesure des taux de production de prostaglandine F2α (PGF2α) dans le milieu de culture [6]. La libération de PGF2α par l’endomètre humain de type prolifératif est directement proportionnelle à l’activité des progestatifs in vitro . La production de

PGF2α par l’endomètre prolifératif constitue donc un paramètre accessible et utile pour l’évaluation des activités relatives des différents composés progestatifs par rapport à la progestérone.

L’action des stéroïdes sexuels sur les cellules endométriales se fait par l’intermé- diaire de récepteurs spécifiques. L’expression de ces récepteurs peut être évaluée par des techniques immunohistochimiques à l’aide d’anticorps monoclonaux dirigés contre les sites antigéniques des récepteurs aux œstrogènes et à la progestérone, montrant une localisation des récepteurs à l’estradiol (RE) et à la progestérone (RP) prédominante dans les noyaux cellulaires de l’endomètre [7-9]. L’utilisation des techniques immunohistochimiques pour la détection des récepteurs hormonaux sur
coupes de tissu congelé ou inclus en paraffine est actuellement validée. De plus, une évaluation quantitative de marqueurs protéiques, par densitométrie sur image microscopique numérisée grâce à un système d’analyse d’image, est aussi accessible sur l’endomètre [10]. De même, l’activité proliférative cellulaire dans les tumeurs, ou dans l’endomètre de type prolifératif peut être évaluée par quantification de l’immuno-expression de l’antigène Ki67 sur coupe de tissu, aussi bien dans les tumeurs de sein [11] que dans l’endomètre [12].

Les progestatifs ont une place importante dans les traitements hormonaux, en particulier les traitements hormonaux substitutifs de la ménopause, en contrôlant la prolifération épithéliale induite par les œstrogènes endogènes ou exogènes sur l’endomètre ou le sein. Dans l’objectif d’une meilleure évaluation de la prolifération épithéliale de l’endomètre, nous avons voulu utiliser un modèle in vitro d’évaluation des effets de traitements hormonaux, comme d’un « hormonogramme », afin de mesurer les effets des stéroïdes sexuels composant les traitements hormonaux substitutifs de la ménopause et, en conséquence, de pouvoir prévenir l’apparition de lésions précancéreuses de l’endomètre. Notre étude a pour but d’évaluer les effets de la progestérone et de trois progestatifs de synthèse couramment utilisés en thérapeutique sur des explants d’endomètre humain de type homogène prolifératif ou hétérogène prolifératif. Cette évaluation se fait par mesure de la production de PGF2 α dans les surnageants de culture et de l’expression immunohistochimique des sites antigéniques de RE, RP et du Ki67.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Les prélèvements d’endomètre humain sont issus de pièces d’hystérectomie, et surtout de curetages biopsiques et sur endométrectomies de patientes n’ayant aucun traitement hormonal pendant au moins deux mois avant l’intervention. Une partie des prélèvements a été inclus en paraffine pour des évaluations diagnostiques et une autre partie a été consacrée à la culture d’explants. Les endomètres ont été datés selon les critères de datation histopathologique habituels [13]. Nous avons de plus individualisé un autre type d’endomètre, appelé « endomètre hétérogène prolifératif » présentant à la fois une composante proliférative prédominante et une composante sécrétoire [1].

Les méthodes de culture d’explants d’endomètre, d’immunohistochimie sur coupes d’endomètre inclus en paraffine avant et après culture pour la détection des antigè- nes de RE, de RP ou de Ki67, ainsi que les méthodes de radioimmunodosage pour la mesure de la production de PGF2α dans les milieux de culture ont été appliquées selon les procédures décrites précédemment [1]. Les antisérums primaires qui ont été utilisés en immunohistochimie sont ER1D5, PR1A6, MIB1 (Immunotech, Marseille, France) tandis que pour les radioimmunodosages, nous avons utilisé un antisérum polyclonal spécifique des PGF2α dilué au 1/15 000ème (Institut Pasteur, Paris, France).

L’évaluation des immunomarquages a été réalisée par un système d’analyse d’images microphotométrique à balayage automatique (SAMBA 2005, Unilog, Grenoble, France) [1].

Les résultats sont exprimés en moyennes fi SEM (SEM : erreur standard sur la moyenne). La significativité des différences entre les moyennes est évaluée par un test de Wilcoxon (Wilcoxon Signed-Rank Test) grâce au logiciel NCSS6.0.

RÉSULTATS

Immunoexpression en Ki67 dans les explants d’endomètre prolifératif

Les explants d’endomètre prolifératif après culture se présentent avec des structures tissulaires bien préservées après 48 h de culture (Fig. 1) et presque toujours, quel que soit leur type histologique, avec leur surface externe recouverte entièrement d’un nouvel épithélium de surface [1]. Le marquage en antigène Ki67 (Fig. 2) a été possible mais positif sur un nombre faible de cellules par explant (variant de 0 à 20 cellules marquées sur une surface de coupes d’explants d’environ 2 mm2), avec une grande variabilité inter- et intra-individuelle. Les études quantitatives par analyse d’image de cet immunomarquage en antigène Ki67 sur explants d’endomè- tre n’ont de ce fait pas été réalisables, contrairement à l’immunomarquage en RE ou RP.

La présence de ce marquage sur les coupes d’explants après culture avec ou sans traitement in vitro est bien le témoin d’une activité proliférative des explants d’endomètre en culture. Mais l’immunomarquage en antigène Ki67 se révèle en pratique difficilement utilisable dans l’endomètre non tumoral, car non quantifiable de façon reproductible.

Effets des progestatifs sur l’accumulation de glycogène

Dans les explants d’endomètres prolifératifs homogènes, nous avons pu observer le développement des vacuoles subnucléaires de glycogène dans les cellules épithéliales glandulaires, induit par l’acétate de nomégestrol, l’acétate de noréthindrone ou l’acétate de médroxyprogestérone, après 25 h de traitement in vitro à la concentration de 10-7 M (Fig. 3).

Effets des progestatifs sur l’immunoexpression en RE et RP

Dans cette étude, nous montrons des effets directs des progestatifs sur l’immunoexpression en RE et RP dans les endomètres prolifératifs. Les progestatifs ont le plus d’effets à la concentration testée la plus élevée (10-7 M) dans tous les types d’endomètre. Les effets in vitro de chaque progestatif sont différents selon le type d’endomètre prolifératif considéré.

Fig. 1. — Explant d’endomètre homogène prolifératif après 48 h de culture. Echelle = 50 µm.

Fig. 2. — Immunomarquage en Ki67 sur une coupe d’explant d’endomètre homogène prolifératif après 48h de culture sans traitement hormonal in vitro . Echelle = 50 µm.

A B Fig. 3. — Accumulation de glycogène après 24 h de traitement in vitro à l’acétate de nomégestrol (10-7 M) dans des explants d’endomètre homogène prolifératif [B] en comparaison au contrôle [A]. Echelle = 50 µm.

A B Fig. 4. — Immunomarquage en RP dans des contrôles [A] et après traitement in vitro au nomégestrol acétate (10-7 M) [B] dans des explants d’endomètre homogène prolifératifs. Echelle = 50 µm.

Fig. 5. —

Effets de la progestérone (10-7 M) in vitro sur les explants d’endomètres prolifératifs (homogènes et hétérogènes) : sur l’immunoexpression en RE et RP dans les glandes (REgl, RPgl) et le stroma (REst, RPst), et sur la production de PGF2α.

Sur les endomètres homogènes prolifératifs (Fig. 5 et 6), la progestérone réduit significativement l’expression des RP à la fois dans les glandes et le stroma, mais n’a aucun effet significatif sur l’expression des RE dans les endomètres prolifératifs homogènes (Fig. 5). L’acétate de nomégestrol (TX) à 10-7M est le seul progestatif qui entraîne une diminution d’expression des deux types de récepteurs, RE et RP, à la fois dans les glandes et le stroma (Fig. 4, Fig. 6). L’acétate de nomégestrol a ainsi

le plus d’effet, en comparaison aux autres progestatifs, sur l’expression en récepteurs des explants d’endomètre prolifératif homogène. Comme la progestérone, tous les progestatifs utilisés dans cette étude, à toutes les concentrations testées (10-7 M, 10-8 M, 10-9 M), induisent une diminution d’expression en RP dans le stroma. En ce qui concerne les glandes, l’expression en RP est également diminuée par l’exposition à la progestérone ou au TX (10-7 M, 10-8 M) mais pas au NOR, ni au MPA. D’autre part, alors que la progestérone n’a aucun effet sur l’immunoexpression en RE, les progestatifs diminuent cette immunoexpression en RE dans les endomètres prolifé- ratifs. En effet, cette diminution d’expression en RE est observée dans les glandes des explants exposés au TX (à 10-7 M et à 10-8 M) ou au NOR (10-7M), et dans le stroma des explants exposés au TX (à toutes les concentrations) ou au MPA (à 10-7 M et 10-9 M).

Sur les endomètres prolifératifs hétérogènes (Fig. 7), la progestérone réduit significativement l’expression des RP dans le stroma mais pas dans les glandes et comme dans les endomètres prolifératifs homogènes, elle n’a pas d’effet significatif sur l’expression en RE (Fig. 5). Dans les endomètres hétérogènes prolifératifs, le MPA (10-7 M) est le seul progestatif qui induit une diminution en RE et RP à la fois dans les glandes et le stroma. L’acétate de médroxyprogestérone a ainsi le plus d’effet sur l’expression des récepteurs dans ce type d’endomètre, en comparaison aux autres progestatifs (Fig. 7). Le TX (à toutes les concentrations) et le MPA (10-7 M) réduisent l’expression en RP dans les glandes, comme la progestérone. Mais contrairement à la progestérone, TX (10-7 M, 10-8 M) diminue aussi l’expression en RP dans les glandes. Le MPA et le TX induisent aussi une diminution de l’expression des RE dans les endomètres hétérogènes prolifératifs. En effet, on observe une diminution d’expression RE induite par le MPA (10-7 M) ou le TX (10-8 M) au niveau des glandes. En ce qui concerne le stroma, le MPA (10-7M) et TX (10-9 M) induisent également une diminution d’expression RE dans les explants d’endomètre hétérogènes prolifératifs. Le NOR n’a pas d’effet significatif sur l’immunoexpression en RE et RP dans les endomètres hétérogènes prolifératifs.

En résumé (Fig. 10 et 11), la progestérone et les progestatifs peuvent diminuer l’expression en RE et RP sur tous les types d’endomètre prolifératif humain. Aucun effet sur l’expression de ces récepteurs n’a été observé par le NOR sur les endomètres hétérogènes prolifératifs. Sur les endomètres prolifératifs homogènes, en revanche, tous les progestatifs agissent en diminuant l’immunoexpression en RE et/ou RP dans les cellules stromales et/ou glandulaires.

Effet des progestatifs sur la production de PGF2 α

La progestérone diminue de manière significative la production de PGF2α par les endomètres prolifératifs homogènes et hétérogènes (Fig. 5).

Les effets des progestatifs de synthèse sont présentés séparément sur les différents types d’endomètre, et en comparaison avec les effets de la progestérone (Fig. 8, 9 et 11).

Fig. 8. —

Production de PGF2 α par les endomètres prolifératifs homogènes , après traitement in vitro à la progestérone à 10-7 M (P), à l’acétate de nomégestrol à 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M (TX7, TX8, TX9), à l’acétate de noréthindrone à 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M (NOR7, NOR8, NOR9) et à l’acétate de médroxyprogestérone à 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M (MPA7, MPA8, MPA9).

* (p<0.05) et ** (p<0.01) indiquent des valeurs significativement différentes des contrôles. Les chiffres entre parenthèses représentent le nombre d’échantillons considérés.

Sur les endomètres prolifératifs homogènes (Fig. 8), le TX et le MPA, à 10-7M et à 10-8M, induisent comme la progestérone (Fig. 5), une diminution significative de la production de PGF2α. A 10-9M, le TX diminue également significativement cette sécrétion, mais pas le MPA qui ne présente pas d’effet significatif à cette dose sur les endomètres homogènes prolifératifs. Le NOR, au contraire, augmente significative-

Fig. 9. —

Production de PGF2 α par les endomètres prolifératifs hétérogènes , après traitement in vitro à la progestérone à 10-7 M (P), à l’acétate de nomégestrol à 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M (TX7, TX8, TX9), à l’acétate de noréthindrone à 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M (NOR7, NOR8, NOR9) et à l’acétate de médroxyprogestérone à 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M (MPA7, MPA8, MPA9).

* (p<0.05) et ** (p<0.01) indiquent des valeurs significativement différentes des contrôles. Les chiffres entre parenthèses représentent le nombre d’échantillons considérés.

Fig. 10. — Tableau récapitulatif des effets des différents progestatifs sur l’immunoexpression en RE et RP. 0 : aucun effet significatif du traitement versus le contrôle ; + augmentation significative versus le contrôle ; — diminution significative versus le contrôle ; NS nombre d’échantillons non significatif.

ment cette sécrétion à 10-9M et n’a pas d’effet significatif aux autres concentrations.

Sur les endomètres homogènes prolifératifs, le MPA et le TX ont les mêmes effets que la progestérone en diminuant la production de PGF2α, et même à des concentrations inférieures à 10-7M. A l’inverse, le NOR augmente significativement la production de PGF2α à 10-9M.

Sur les endomètres prolifératifs hétérogènes (Fig. 9), seul le TX et le MPA présentent, comme la progestérone (Fig. 5) des effets sur la production de PGF2α. A 10-7 et 10-8 M, le TX diminue la sécrétion de PGF2α par ces endomètres, comme la progestérone. A 10-9 M, le MPA diminue également cette production de PGF2α.

Ces résultats concernant les PGF2α sont résumés dans le tableau (Fig. 11).

Fig. 11. — Tableau récapitulatif des effets des traitements des différents progestatifs sur la production de PGF2α. 0 : aucun effet significatif du traitement versus le contrôle ; + augmentation significative versus le contrôle ; — diminution significative versus le contrôle ; NS nombre d’échantillons non significatif.

DISCUSSION

En culture, l’endomètre présente des signes histologiques d’une activité cellulaire proliférative. Le processus de ré-épithélialisation in vitro s’apparente à celui qui se fait in vivo en phase régénérative du cycle menstruel, avec régénération de la surface externe par un nouvel épithélium de surface et qui représente une des fonctions de l’endomètre de renouveler sa surface complètement après chaque menstruation ou après une grossesse [14]. Nous avons observé ainsi, sur tous les explants, le résultat d’une régénération in vitro de l’endomètre [1]. Ce processus est très probablement le même que celui qui se produit après une exérèse biopsique d’endomètre à des fins diagnostiques. In vivo , il est le reflet des activités de migration et de prolifération des
cellules épithéliales auxquelles participeraient les cellules stromales [14].

In vitro cette activité proliférative du tissu est bien mise en évidence par la ré-épithé- lialisation de nos explants, également observée par d’autres auteurs [15, 16] et par la présence des antigènes Ki67 (immunoréaction positive sur les explants), ce qui montre bien la bonne viabilité des explants dans notre modèle.

L’anticorps monoclonal Ki67 reconnaît un antigène nucléaire présent dans les cellules en état de prolifération, mais absent dans les cellules quiescentes, donc cet anticorps est dirigé contre un antigène nucléaire associé à la prolifération [17]. Dans l’endomètre normal, la phase proliférative du cycle menstruel est bien caractérisée par une expression en Ki67 dans l’endomètre humain [12, 18] et en pathologie, une corrélation significative existe entre la proportion des cellules positives au Ki67 et le grade histopronostique des tumeurs, notamment mammaires [19].

A notre connaissance, concernant l’endomètre, une seule étude in vitro a révélé un immunomarquage en Ki67 sur des cellules épithéliales en culture primaire, et a montré qu’il est diminué après traitement in vitro aux androgènes [20]. Notre étude révèle pour la première fois la présence d’antigène Ki67 par immunohistochimie sur des explants d’endomètre après culture. Ce marquage est cependant décevant, puisque trop faible, il ne permet pas une évaluation quantitative par analyse d’image automatique. Il est ainsi inutilisable sur ce type de tissu in vitro , du fait d’un faible marquage avec une trop grande variabilité inter— et intra-individuelle.

En perspective, d’autres approches expérimentales de l’état de prolifération endométriale in vitro restent néanmoins envisageables. Il pourrait être possible d’utiliser d’autres marqueurs de prolifération que Ki67, comme PTEN, protéine exprimée par un gène de suppression tumorale [21]. La réduction de l’expression protéique de ce marqueur, en conséquence de mutation du gène PTEN (« tumor suppressor gene ») dans les lésions hyperplasiques et cancers de l’endomètre, indiquerait ainsi une augmentation de la prolifération cellulaire. Il semblerait que son expression immunohistochimique puisse être quantifiable de façon reproductible [21].

Les progestatifs n’ont pas d’effets identiques sur les différents types d’endomètre en culture, que ce soit pour l’immunoexpression en RE et RP ou pour la production de PGF2α.

Les variations de production de PGF2α observées dans notre étude semblent bien être le reflet de l’activité progestative de composés hormonaux, comme cela a été montré par d’autres travaux [6]. En effet la progestérone, ainsi que tous les progestatifs testés, diminue cette sécrétion par les deux types d’endomètre prolifératif en culture, à l’exception du NOR (à 10-9M) dans les cultures d’endomètre homogène prolifératif. Le TX, le MPA et la progestérone ont des effets similaires sur la production de PGF2α qui est diminuée significativement après 25h d’exposition à ces composés dans les cultures d’endomètres homogènes et hétérogènes prolifératifs.

Le NOR se distingue des autres progestatifs, en induisant un effet inverse, qui est celui d’augmenter cette production dans les endomètres homogènes prolifératifs alors que dans les endomètres hétérogènes, le NOR n’a aucun effet significatif. Cet
effet du NOR sur la production de PGF2α par les endomètres prolifératifs pourrait être le reflet de l’activité œstrogénique de ce composé, puisque c’est un effet opposé à celui des autres progestatifs testés dépourvus d’activité œstrogénique [22], donnée importante suggérant un impact de ce progestatif sur la prolifération épithéliale.

Sur l’immunoexpression en RE et RP, les effets induits par les progestatifs sont des diminutions d’expression en RE et/ou RP sur les endomètres prolifératifs, en accord, en général, avec d’autres études in vitro sur cellules endométriales isolées avec traitement à la progestérone [23] ou au MPA [24, 25], ou avec d’autres études in vivo ayant testé les effets de la progestérone [26], du MPA [27], du NOR [28] ou du TX chez le macaque [29]. Les explants d’endomètres prolifératifs réagissent en ce sens à tous les progestatifs et avec le plus d’effets aux plus fortes concentrations testées. Le TX est le progestatif qui peut agir sur les deux types de récepteurs qu’il s’agisse des glandes et du stroma des endomètres homogènes prolifératifs, tandis que sur les endomètres hétérogènes prolifératifs, c’est le MPA qui présente cette même palette d’action. La progestérone diminue uniquement l’expression en RP dans les glandes et le stroma, alors que les progestatifs synthétiques diminuent l’expression en RP et RE dans les endomètres prolifératifs. En revanche, le NOR n’a aucun effet significatif sur l’expression en RE et RP sur les endomètres hétérogènes prolifératifs.

Les endomètres hétérogènes sont à considérer et à mieux définir in vivo et in vitro .

Ces endomètres, proches des endomètres homogènes selon leur profil d’immunomarquage en récepteurs stéroïdiens, se sont révélés être des endomètres qui ont une forte activité proliférative non négligeable bien que leur réponse in vitro soit diffé- rente de celle des endomètres homogènes. Ces cas d’endomètre étant anormaux et fréquemment observés en périménopause, ils méritent d’être mieux cernés, non seulement sur le plan morphologique mais également in vitro , et suivis sur le plan clinique.

En conclusion, ce travail a posé la première pierre des applications d’études immunohistochimiques sur les explants d’endomètre humain après culture, puisque aucune étude n’avait évalué les variations d’expression des récepteurs à l’estradiol et à la progestérone par immunohistochimie quantitative. Concernant l’immunoexpresssion en sous-types des récepteurs aux stéroïdes, notre étude a permis d’évaluer les taux d’immunoexpression en REα et ceux de l’ensemble des deux types de RP (A et B). A la suite de ce travail, on pourra également déterminer ceux en REβ et séparément ceux en RP-A et RP-B, pour tenter de mieux comprendre le mécanisme d’action des progestatifs sur les RE et RP.

Notre étude a ainsi constitué une première étape indispensable qui ouvre en perspective de nombreuses possibilités d’études sur le tissu endométrial en culture d’explant, notamment dans le cadre de l’étude de l’activité de prolifération endométriale in vitro .

La ré-épithélialisation mise en évidence sur les explants d’endomètre en culture, est le témoin d’une activité proliférative du tissu en culture. L’immunomarquage en antigène de prolifération Ki67, bien que marqueur de référence en diagnostic pour
la détection de lésions hyperplasiques ou cancéreuses sur les tissus humains, n’a pas donné de résultats exploitables sur les explants d’endomètres normaux in vitro . Il semble important de continuer dans une voie qui permettrait de déterminer le marqueur de prolifération idéal et utilisable in vitro sur l’endomètre humain en culture. En plus des résultats d’immunomarquage des récepteurs stéroïdiens, ceux des marqueurs de prolifération spécifiques de l’endomètre humain pourraient ainsi constituer une fenêtre sur l’évaluation directe de l’état fonctionnel du tissu in vitro après traitement hormonal et ouvre, en perspective à long terme, une meilleure adaptation individuelle des traitements aux progestatifs, seuls ou associés, notamment dans le cadre du traitement substitutif de la ménopause.

REMERCIEMENTS

Les auteurs adressent leurs remerciements au Conseil Général des Bouches du Rhône, au Conseil régional de la région PACA et aux Laboratoires Theramex pour leur aide dans le financement de ces travaux.

BIBLIOGRAPHIE [1] Illouz S., Boubli L., Lavaut M.N., Allasia C., Charpin C. — Endometrial response to sexual steroids as assessed by prostaglandin F2a output in explant culture and hormone receptor expression. Gynecol. Obstet. Invest., 2000, 50, 43-49.

[2] Dallenbach-Hellweg G. — The normal histology of the endometrium.

In : Histopathology of the endometrium (third edition)/ Dallenbach-Hellweg G (ed). Berlin : Springer-Verlag, 1981, 23-82.

[3] Philippe E., Charpin C. — Endomètre. In : Pathologie gynécologique et obstétricale. Paris :

Masson, 1992, 73-125.

[4] Whitehead M.I., Townsend P.T., Pryse-Davies J., Ryder T.A., King R.J.B. — Effects of œstrogens and progestins on the biochemistry and the morphology of the postmenopausal endometrium. New Engl. J. Med ., 1981 , 305 , 1599-1605.

[5] Beresford S.A.A., Weiss N.S., Voigt L.F., Mcknight B. — Risk of endometrial cancer in relation to use of œstrogen combined with cyclic progestogen therapy in postmenopausal women. Lancet , 1997, 349, 458-461.

[6] Markiewicz L., Gurpide E. —

In vitro bioassays for drugs with dual œstrogenic and progestagenic activities.

Ann. New York Acad. Sci ., 1994, 734 , 285-217.

[7] Garcia E., Bouchard P., De Brux J., Berdah J., Frydman R., Schaison G., Milgrom E., Perrot-Applanat M. — Use of immunohistochemistry of progesterone and œstrogen receptors for endometrial dating. J. Clin. Endocrinol. Metab ., 1988, 67 , 80-87.

[8] Bouchard P., Marraoui J., Massai M.R., Medalie D.A., de Ziegler D., Perrot-Applanat M., Frydman R., Bergeron C. — Immunohistochemical localization of estradiol and progesterone receptors in human endometrium : a tool to assess endometrial maturation. Baillière’s Clin. Obstet. Gynaecol. , 1991, 5 , 107-115.

[9] Fujishita A., Nakane P.K., Koji T., Masuzaki H. — Expression of œstrogen and progesterone receptors in endometrium and peritoneal endometriosis : an immunohistochemical and in situ hybridization study. Fertil. Steril ., 1997, 67 , 856-864.

[10] Charpin C., Martin P.M., Lavaut M.N., Pourreau-Schneider N., Toga M. — Œstrogen receptor immunocytochemical assay (ER-ICA) in human endometrium. Int. J. Gynecol.

Pathol. , 1986, 5, 119-131.

[11] Charpin C., Andrac L., Vacheret H., Habib M.C., Devictor B., Lavaut M.N., Toga M. — Multiparametric evaluation (SAMBA) of growth fraction (monoclonal Ki67) in breast carcinoma tissue sections. Cancer Res ., 1988, 48 , 4368-4374.

[12] Charpin C., Andrac L., Habib M.C., Vacheret H., Lavaut M.N., Xerri L., Toga M. — Immunocytochemical assays in human endometrial carcinomas : a multiparametric computerized analysis and comparison with nonmalignant changes. Gynec. Oncol., 1989, 33 , 9-23.

[13] Noyes R.W., Hertig A.T., Rock J. — Dating the endometrial biopsy.

Fertil. Steril., 1950 , 1 , 3-26.

[14] Russel P., Fraser I.S. — The practical assessment of endometrial morphology and function .

In : Clinical disorders of the endometrium and menstrual cycle/ Cameron IT, Fraser IS, Smith

SK (eds). Oxford : Oxford University Press, 1998, p. 46-66.

[15] Kaufman D.G., Adamec T.A., Walton L.A., Carmey C.N., Melin S.A., Genta V.M., Mass M.J., Dorman B.H., Rofgers N.T., Photopulos G.J., Powell J., Grisham J.W. — Studies of human endometrium in organ culture. In : Methods in cell biology, Volume 22B/ Harris CC,

Trump BF, Stoner GD (eds). New York : Academic Press, 1980, 1-28.

[16] Marbaix E., Cornillie F.J., Eeckhout Y., Courtoy P.J. — Applications de la culture organotypique de l’endomètre humain : perspectives nouvelles dans l’évaluation des modifications morphologiques de l’endomètre humain. Contracept. Fertil. Sex ., 1990, 18 , 895-899.

[17] Gerdes J., Schwab U., Lemke H., Stein H. — Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer , 1983, 31 , 13-20.

[18] Morsi H.M., Leers M.P., Jager W., Bjorklund V., Radespiel-Troger M., El Kabarity H., Nap M., Lang N. — The patterns of expression of an apopotosis-related CK18 neoepitope, the bcl-2 proto-oncogene, and the Ki67 proliferation marker in normal, hyperplastic, and malignant endometrium. Int. J. Gynecol. Pathol., 2000, 19, 118-127.

[19] Gerdes J., Lelle R., Pickartz H., Heidenreich W., Schwating R., Kurtsiefer L., Stauch G., Stein H. — Growth fractions in breast cancers determined in situ with monoclonal antibody

Ki-67.

J. Clin. Pathol ., 1986, 39 , 977-980.

[20] Tuckerman E.M., Okon M.A., Laird S.M. — Do androgens have a direct effect on endometrial function ? An in vitro study. Fertil. Steril ., 2000, 74 , 771-779.

[21] Mutter G.L. — I. Histopathology of genetically defined endometrial precancers.

In J. Gynecol.

Pathol., 2000 , 19 , 301-309.

[22] Botella J., Duranti E., Viader V., Duc I., Delansorme R., Paris J. — Lack of œstrogenic potential of progesterone or 19-nor-progesterone-derived progestins as opposed to testosterone or 19-nor-testosterone derivatives on endometrial Ishikawa cells . J. Steroid Biochem. Mol. Biol ., 1995, 55 , 77-84.

[23] Iwai M., Kanzaki H., Fujimoto M., Kojima K., Hatayama H., Inoue T., Higuchi T., Nakayama H., Mori T., Fujita J. — Regulation of sex steroid receptor gene expression by progesterone and testosterone in cultured human endometrial stromal cells. J. Clin. Endocrinol.

Metab., 1995, 80, 450-454.

[24] Tseng L., Zhu H.H. — Regulation of progesterone receptor messenger ribonucleic acid by progestin in human endometrial stromal cells. Biol. Reprod., 1997, 57 , 13660-13666.

[25] Classen-Linke I., Kusche M., Knauthe R., Beier H.M. — Establishment of a human endometrial cell culture system and characterization of its polarized hormone responsive epithelial cells. Cell Tissue Res., 1997, 287, 171-185.

[26] Janne O., Ylostalo P. — Endometrial œstrogen and progestin receptors in women bearing a progesterone-releasing intrauterine device. Contraception , 1980, 23 , 19-24.

[27] Kauppila A., Vierikko P., Isotalo H., Ronnberg L., Vihko R. — Cytosol œstrogen and progestin receptor concentrations and 17 β-hydroxysteroid dehydrogenase activities in the endometrium and endometriotic tissue. Effects of hormonal treatment. Acta Obstet. Gynecol.

Scand. Suppl., 1984, 124, 45-49.

[28] Kasid A., Laumas K.R. — Nuclear progestin receptors in human uterus.

Endocrinology, 1981, 109, 553-560.

[29] Williams J.K., Cline J.M., Honoré E.K., Delansorme R., Paris J. — Coadministration of nomegestrol acetate does not diminish the beneficial effects of estradiol on coronary artery dilator responses in nonhuman primates (Macaca fascicularis). Am. J. Obstet. Gynecol ., 1998, 179 , 1288-1214.

DISCUSSION

M. Jean-Daniel SRAER

Quel est le rationnel du dosage de la PGF2 α ? Qu’en est-il de la balance PGE2-PGF2 α en fonction de la stimulation de l’endomètre par les progestatifs ?

Le mécanisme d’action des hormones sur la production de PGF2α n’est pas connu.

Néanmoins, dans le modèle initialement décrit par Gurpide, la réponse de l’endomètre, cultivé sous forme d’explants, est très rapide en termes de production et libération de PGF2α dans les surnageants. La PGF2α étant un marqueur fiable de réponse aux oestrogènes ou la progestérone en fonction de l’état sécrétoire ou prolifératif de l’endomètre, nous n’avons utilisé que le dosage de la PGF2α et non pas de la PGE2. Il est néanmoins probable que cette dernière fluctue de façon concomitante à la PGF2 α.

M. Claude DREUX

Vous avez étudié l’action des progestatifs couramment utilisés dans les THS de la ménopause, mais qu’en est-il des associations oestrogènes + progestatifs utilisés en France ?

Le but du développement du modèle est effectivement de tester les associations oestrogènes et progestatifs. Néanmoins, pour valider le modèle, nous avons dû vérifier un certain nombre de paramètres, nous mettant dans les conditions expérimentales les plus simples, à savoir d’une part des endomètres sécrétoires ou prolifératifs et essentiellement prolifératifs dans un premier temps, et d’autre part une stimulation simple aux oestrogè- nes et progestatifs. Les oestrogènes utilisés en France étant effectivement différents des oestrogènes utilisés aux Etats-Unis, nous avons vérifié que le modèle fonctionnait en présence d’oestradiol à des concentrations variables. L’action des oestrogènes, notamment d’oestradiol, utilisés en France étant bien connue, nous nous sommes surtout focalisés sur l’évaluation des progestatifs qui sont plus hétérogènes et dont l’action est moins claire. En ce qui concerne les oestrogènes, il s’agit plus d’une question de posologie que de nature de molécule. En ce qui concerne les progestatifs, la nature des molécules en même temps que la posologie sont à prendre en considération de façon égale. L’objectif de notre travail étant anatomo-clinique, dans le cadre d’un contrôle de la maîtrise de la
prolifération oestro-induite par les progestatifs, nous avons ciblé notre étude sur l’action des progestatifs sur l’endomètre prolifératif. Il est évident que la suite des travaux s’oriente vers l’utilisation de produits plus diversifiés et plus complexes, seuls ou associés, notamment dans l’association oestrogènes-progestatifs utilisée en France dans le cadre des traitements hormonaux substitutifs de la ménopause.

M. Michel BOUREL

De combien de temps dispose-t-on avant la dégradation cellulaire pour juger des qualités fonctionnelles du cytoplasme en culture ? De quelles bases comparatives dispose-t-on pour l’évaluation du type de l’endomètre mis en culture ?

Les explants d’endomètre non dissociés sont utilisables jusqu’à 72 heures. Avant 72 heures, les structures, notamment les rapports glandes stromales, sont bien préservées et utilisables pour les tests morphologiques, notamment immunohistochimiques. Au-delà de 70 heures, la dégradation tissulaire rend aléatoire les immunoréactions d’une part et l’évaluation quantitative de la sécrétion épithéliale et de la réactivité immunohistochimique, d’autre part. En ce qui concerne les bases comparatives, le protocole inclus dans le modèle décrit en comporte deux. La première correspond au prélèvement initial, fixé au formol et effectué dans un but diagnostique, qui permet une évaluation dans des conditions techniques correctes et standardisées, du type d’endomètre : prolifératif, homogène ou hétérogène, sécrétoire, homogène ou hétérogène, dans le cadre des lésions fonctionnelles ou néoplasiques. La deuxième phase comparative correspond au témoin interne qui est un fragment (explant) mis en culture dans les mêmes conditions, et la même durée, sans exposition aux progestatifs testés. Les variations (augmentation ou diminution) de la sécrétion, des mitoses, de l’expression immunohistochimique des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone, et de la production de la PGF2α dans le surnageant, sont évaluées par rapport à celles du contrôle interne. Dans les résultats présentés, nous nous sommes mis dans des conditions techniques optimales avec une stimulation de 24 heures des explants, et une exploitation des tissus pour l’étude morphologique des surnageants de 24 à 48 heures.

Bull. Acad. Natle Méd., 2002, 186, no 1, 125-146, séance du 29 janvier 2002