* Lauréat du Prix de l’Académie nationale de médecine en 1999

Unité 460 de l’INSERM, CHU X. Bichat, 16 rue Henri Huchard — 75018 Paris.

Tirés-à-part : Docteur Jean-Baptiste MICHEL, à l’adresse ci-dessus.

Article reçu le 9 janvier 2001, accepté le 5 février 2001.

INTRODUCTION

Le rejet chronique est un phénomène complexe, qui grève le pronostic à long terme des transplantations d’organes. Parmi les lésions histologiques observées, les lésions vasculaires décrites sous le terme d’artériosclérose du greffon [1], et le fait qu’elles représentent une lésion commune observée en transplantation rénale, cardiaque et hépatique, en font une cible thérapeutique d’importance dans ce contexte [2]. Elle est caractérisée par la présence conjointe au sein de la paroi artérielle d’une prolifération intimale concentrique qui réduit le calibre de la lumière artérielle, d’une disparition des cellules musculaires lisses médiales et d’une infiltration inflammatoire de l’adventice [3].

La greffe d’aorte constitue un bon modèle d’étude du rejet artériel chronique [4, 5].

Elle est plus simple de réalisation qu’une transplantation d’organe, et permet d’étudier de manière focale les mécanismes et les effets du rejet sur les trois tuniques facilement identifiables de la paroi artérielle sans l’inconvénient de la présence d’un parenchyme adjacent. La rectitude des parois rend la quantification facile. Nos travaux antérieurs ont montré que l’allo-antigénicité de la paroi artérielle est due exclusivement à sa composante cellulaire, la matrice extracellulaire n’étant pas antigénique en allogreffe [6]. De ce fait, l’objectif de notre travail a été de préciser, à travers le modèle expérimental de la greffe d’aorte chez les rats, les cibles cellulaires du rejet artériel chronique et les effecteurs moléculaires de ce rejet chronique. Enfin dans une dernière étape, nous avons essayé de prévenir le rejet chronique par ensemencement endovasculaire de cellules autologues au receveur.

Une des caractéristiques du modèle est l’absence de cellules immuno-inflammatoires véhiculées par le greffon. Contrairement aux greffes d’organe plein, dans le modèle de greffe vasculaire, il n’y a pas de leucocytes migrants du greffon vers l’hôte, amenant une information immunologique directe de type « mixed lymphocyte réaction (MLR) » du système immunitaire du donneur vers le receveur. Dans le modèle de greffe vasculaire, la reconnaissance de l’histocomptabilité est de type indirect nécessitant la maturation des antigènes d’histocompatibilité du donneur par le système immunitaire du receveur (présentation indirecte). Schématiquement, on peut opposer le rejet aigu de greffe d’intestin, où le conflit immunologique direct entre les cellules immunocompétentes du greffon et celles de l’hôte est majeur, au rejet chronique de greffe artérielle, où la reconnaissance par le système immunitaire du receveur n’est qu’indirecte, retardée, progressive, d’où le caractère chronique de ce type de rejet, correspondant à une physiopathologie propre, différente de celle du rejet aigu.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Le modèle expérimental in vivo est simple. Il consiste à greffer en position orthotopique, une aorte sous-rénale (1 cm de long) provenant d’une souche pure (syngéni-
que, monomorphe pour le système majeur d’histocompatibilité) de rat sur une autre souche pure de rat ; les deux étant histo-incompatibles, c’est-à-dire différentes par les haplotypes (polymorphes) de leurs systèmes d’histocompatibilité, en particulier le MHC de classe 1 [5]. Les animaux peuvent être présensibilisés par des greffes de peau répétées [7].

Les modèles cellulaires sont également simples. Ils consistent à mettre en culture primaire les cellules vasculaires : cellules endothéliales, cellules musculaires lisses de la média et de la prolifération intimale, fibroblastes de l’adventice, selon une méthode mise au point dans notre laboratoire [8]. Les cellules peuvent être cultivées soit à partir d’artères des donneurs, soit à partir d’artères du receveur. Ces cultures primaires, in vitro , associées à la greffe in vivo , font l’originalité de notre démarche expérimentale. Les autres méthodes sont classiques : préparation des sérums et des anticorps, immunohistochimie, morphométrie quantitative des différentes couches de la paroi, mise en évidence de l’apoptose, cytométrie en flux…

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Aspects morphologiques

Notre équipe [5] et d’autres [4] ont décrit les composantes morphologiques du rejet chronique artériel. Chaque couche de la paroi artérielle a un comportement spécifique au cours du rejet chronique :

— l’intima est caractérisée par une importante prolifération de cellules musculaires lisses. C’est cette prolifération qui aboutira à l’obstruction des artères (artériosclérose du greffon) rendant compte d’une grande partie de la pathologie rencontrée au cours du rejet chronique ;

— la média artérielle est caractérisée par la disparition des cellules musculaires lisses (CML), sans inflammation, respectant la matrice extracellulaire ;

— l’adventice est le siège d’un infiltrat cellulaire inflammatoire intense persistant.

A un stade tardif, l’adventice est le siège d’une fibrose de réparation .

Paradoxe de la disparition des CML de la média et de leur prolifération dans l’intima

Lors de nos premiers travaux, nous avions observé un comportement indépendant de la disparition des cellules musculaires lisses de la média et de la prolifération intimale, suggérant que la physiopathologie du rejet chronique pour ce qui est de la prolifération intimale était différente de celle de la disparition des CML de la média [5]. A l’opposé, nous observions une relation positive entre l’accumulation de cellules immuno-inflammatoires dans l’adventice et la persistance des CML allogé- niques du donneur dans la média [9]. Ces résultats nous ont conduits à quelques hypothèses, qui ont guidé la poursuite de notre travail :

— l’inflammation adventicielle et la disparition des cellules musculaires lisses de la média témoignent de l’agression de la paroi artérielle du greffon par le système immunitaire du receveur ;

— l’intensité de l’inflammation dans l’adventice contrastant avec l’absence de cellules inflammatoires dans la média, suggérait que l’effecteur immunologique de la disparition des cellules musculaires lisses de la média n’était pas de type cellulaire ;

— le contraste entre la présence d’une prolifération musculaire lisse dans l’intima et leur disparition de la média, suggérait une origine différente des CML de la prolifération intimale, non rejetées au cours du temps et probablement non antigéniques.

Évolution temporelle du rejet chronique

Dans un premier travail de caractérisation des effecteurs et des cibles du rejet chronique, nous nous sommes attachés à décrire la chronologie des événements cellulaires aboutissant aux aspects morphologiques sus-décrits [10]. Ce travail d’immuno-histochimie et de morphologie cellulaires a montré que les cellules endothéliales allogéniques du greffon, du fait de leur position à l’interface du sang circulant, véhiculant les cellules immunocompétentes de l’hôte et de la paroi arté- rielle, cible du rejet chronique, jouent un rôle prédominant dans la voie indirecte de l’alloreconnaissance. Elles sont la première cible, sous forme d’une margination des macrophages dès le 3ème jour post-greffe et une disparition totale de l’endothélium au 15ème jour. Ces résultats ont été récemment confirmés [11]. La média, contenant les cellules musculaires lisses, est un site relativement privilégié. La juxtaposition des lames élastiques la rend difficilement accessible aux effecteurs immunologiques cellulaires, ce qui en fait la cible chronique d’un rejet à médiation non cellulaire.

Nous avons mis en évidence la présence d’immunoglobulines G dans la média suggérant une agression immune à médiation humorale de la média. La prolifération intimale apparaît progressivement, après la phase de disparition de l’endothé- lium, de façon concomitante avec la disparition des CML de la média. Au départ la prolifération intimale est mixte, composée de CML et de cellules inflammatoires (essentiellement des macrophages). A un stade tardif, elle n’est plus constituée que de CML et de fibrose témoignant d’un état de cicatrisation. Il en est de même de l’adventice, qui après avoir été le siège d’une infiltration cellulaire inflammatoire, essentiellement constituée de lymphocytes T helper, va évoluer vers une fibrose de réparation extrêmement intense, quasiment acellulaire.

Ces observations nous permettent de conclure que le rejet chronique évolue en trois phases :

— une phase afférente du greffon vers l’hôte d’alloreconnaissance indirecte initiée par les cellules endothéliales ;

— une phase d’agression immune chronique aboutissant à la disparition des cellules cibles allogéniques, en particulier des cellules musculaires lisses de la média ;

— une phase de cicatrisation correspondant à une prolifération intimale musculaire lisse et fibreuse et à une fibrose adventicielle associée à une disparition de toutes les cellules allogéniques.

Ces résultats posaient deux questions : quelle est l’origine des cellules de la prolifé- ration intimale ne semblant pas antigéniques ? Quels sont les effecteurs de la disparition des cellules musculaires lisses de la média ?

Origine de la prolifération intimale

Pour répondre à ces questions, nous avons utilisé la méthode de la présensibilisation croisée entre les deux souches, pour obtenir un titre élevé d’anticorps dirigés contre les déterminants allogéniques portés par les cellules du donneur. Ces anticorps nous ont permis de caractériser la provenance des CML de la prolifération intimale tardive. Les CML de la prolifération intimale, mises en culture, sont reconnues par les anticorps anti-receveurs et non par les anticorps anti-donneurs (cytométrie de flux) démontrant qu’il s’agit bien là d’un processus cicatriciel, dont l’effecteur est la cellule musculaire lisse du receveur et non celle du donneur [10]. Ces résultats relatifs à l’origine « receveur » de la prolifération intimale ont été confirmés depuis par d’autres équipes. Une équipe néerlandaise, en utilisant des donneuses femelles et des receveurs mâles, a montré que les cellules de la prolifération intimale portaient le chromosome Y prouvant qu’elles provenaient du receveur [12]. Des résultats similaires ont été montrés dans les allogreffes veineuses chez l’homme [13]. Récemment, l’équipe de Boston, en utilisant le modèle de greffe d’aorte chez la souris, et des souris transgéniques surexprimant le gène Lac-Z codant pour la β-galactosidase comme receveur, a montré que les cellules de la prolifération intimale se colorant en bleu en présence du substrat chromogénique de la β-galactosidase, confirmant l’origine receveur des cellules musculaires lisses de la prolifération intimale [14]. Ces auteurs suggèrent en outre une origine médullaire (progéniteurs) pour une partie (10 à 20 %) des cellules musculaires lisses intimales.

Présensibilisation humorale

Ces expériences de présensibilisation ont confirmé notre concept de l’évolution du rejet chronique en trois phases [15]. La présensibilisation, par trois greffes de peau provenant du donneur, accélère considérablement le phénomène de rejet chronique sans en modifier profondément la physiopathologie. L’existence d’anticorps préformés, dirigés contre le MHC du donneur, supprime la phase d’afférence, raccourcit la phase d’agression, et limite la phase de cicatrisation. Les immunoglobines préexistantes s’accumulent instantanément sur les cellules endothéliales, puis rapidement sur les cellules musculaires lisses de la média entraînant leur disparition précoce. In fine , l’infiltration inflammatoire de l’adventice est moins intense, la cicatrice plus précoce et plus limitée, en particulier au niveau de l’intima où la prolifération musculaire lisse est moins abondante et mieux organisée (plus riche en élastine).

Cible cellulaire de la réponse humorale

Ces anticorps nous ont permis, en outre, de caractériser la médiation humorale du rejet allogénique des cellules musculaires lisses de la média [16]. Pour cela, les sérums de rats receveurs, présensibilisés ou non, sont mis en présence de CML en culture provenant du donneur. Les anticorps contenus dans le sérum du receveur reconnaissent le MHC de classe 1 porté par les cellules du donneur. Cette reconnaissance est proportionnelle à la quantité d’anticorps présente dans le sérum. Elle est inhibée de façon compétitive par des anticorps spécifiques du MHC de classe-1 (monoclonaux). Les immunoglobulines G éluées des greffons ont les mêmes caractéristiques.

Surtout ces anticorps entraînent la mort progressive des cellules cibles [16]. Que des anticorps anti-MHC-1 puissent entraîner l’apoptose des cellules cibles indépendamment de tout autre effecteur cellulaire (macrophage) ou moléculaire (complé- ment), avait déjà été montré dans un système d’anticorps monoclonaux (souris) reconnaissant le MHC-1 de la lignée lymphocytaire jurkat humaine [17]. Notre travail démontre pour la première fois que ce phénomène existe dans le cadre de l’allogénicité. De plus, il n’est pas limité aux CML ; les anticorps anti-classe-1 sont capables d’induire l’apoptose des cellules cibles allogéniques proportionnellement à l’expression des molécules de classe 1 à leur surface, faisant de cet effecteur humoral un effecteur commun au rejet chronique. Ce résultat explique la disparition progressive des CML de la média et l’absence d’inflammation qui l’accompagne. Il confirme la nature non allogénique des cellules de la prolifération intimale. Il s’accompagne d’une baisse du taux circulant d’anticorps lors de la greffe, traduisant leur adsorption dans le tissu allogénique.

De ce fait, un traitement, sous la forme d’une association, visant à la fois la réponse immunitaire et la prolifération intimale, est particulièrement efficace pour prévenir le rejet chronique. C’est ce que nous avons expérimenté en associant une héparine de bas poids moléculaire, dénuée d’effet anticoagulant, capable d’inhiber la prolifération des CML, et la cyclosporine à faible dose ciblant la réponse immunitaire [9]. Si l’héparine seule n’a d’effet que sur la prolifération intimale, et si la cyclosporine ne fait que ralentir le développement du rejet chronique, l’association des deux a une très forte interaction bénéfique dans la prévention du rejet chronique dans notre modèle.

Ensemencement endoluminal thérapeutique de cellules syngéniques au receveur

En clinique, la prolifération intimale représente le phénomène majeur de l’artériosclérose de transplantation en rapport avec l’agression immunologique de la paroi.

Nos résultats montraient que cette prolifération intimale était en rapport avec un phénomène de cicatrisation par les cellules autologues du receveur. Notre hypothèse a donc été que l’ensemencement préalable de CML syngéniques sur la face endoluminale du vaisseau préviendrait en partie cette prolifération excessive. Pour cela, des cellules musculaires lisses et des fibroblastes syngéniques au receveur ont été culti-
vées puis ensemencées sur la face interne des allogreffes artérielles et comparées à l’absence d’ensemencement. L’ensemencement de cellules syngéniques ne prévient pas le rejet chronique (disparition progressive des cellules allogéniques). En revanche, l’ensemencement des CML syngéniques est extrêmement efficace pour prévenir la prolifération intimale : diminution considérable d’épaisseur de l’intima (- 60 %), en rapport avec une diminution du nombre de cellules (- 60 %), et un enrichissement en élastine (+ 50 %). L’ensemencement de fibroblastes syngéniques au receveur diminue aussi considérablement le nombre de cellules intimales (- 50 %), mais ne parvient pas à diminuer significativement l’épaisseur de l’intima, du fait d’une accumulation importante de collagène (+ 30 %). L’ensemencement des cellules musculaires lisses autologues représente donc un outil de thérapie cellulaire intéressant pour prévenir de l’accumulation intimale de matériel cellulaire et matriciel.

CONCLUSION

Ces travaux, à travers une approche expérimentale originale, nous ont permis de répondre à un certain nombre de questions d’ordre physiopathologique concernant les mécanismes du rejet chronique dans sa localisation artérielle : origine réceptrice des cellules de la prolifération intimale, nature humorale de l’agression médiale… Ils ouvrent des perspectives de thérapie cellulaire autologue chez l’homme. Ils montrent ce que pourrait être une recherche clinique moderne sur le rejet chronique : une banque cellulaire établie à partir de tissus du donneur au moment du prélèvement d’organe permettrait, au-delà de la culture mixte lymphocytaire initiale, de mieux appréhender les mécanismes et les thérapeutiques du rejet chronique.

BIBLIOGRAPHIE [1] FOEGH M. — Chronic rejection-graft arteriosclerosis.

Transplant. Proc., 1990, 22 , 119.

[2] RADIO S., WOOD S., WILSON J., LIN H., WINTERS G., MC MANICS B. — Allograft vascular disease : comparison of heart and other grafted organs. Transplant. Proc., 1996, 28 , 496-499.

[3] DEMETRIS A., ZERBE T., BANNER B. — Morphology of solid organ allograft arteriopathy :

identification of proliferating intimal cell population. Transplant. Proc., 1995, 21 , 3667.

[4] HÄYRY P., MENNANDER A., TIISLA S. et al . — Rat aortic allograft : an experimental model for chronic transplant arterioscleriosis.

Transplant. Proc., 1991, 23 , 611-612.

[5] PLISSONNIER D., LEVY B.I., SALZMANN J.L., NOCHY D., WATELET J., MICHEL J.B. — Allograft induced arterial wall injury and reponse in normotensive and spontaneously hypertensive rats.

Arterioscl. Thromb ., 1991, 11 , 1690-1699.

[6] ALLAIRE E., GUETTIER C., BRUNEVAL P., BENSENANE S., BECQUEMIN J.P., MICHEL J.B. — Cell-free arterial grafts : morphologic characteristics of aortic isografts, allografts and xenografts in rats. J. Vasc. Surg ., 1994, 19 , 446-456.

[7] FORBES R.D.C., KURAMOCHI T., GUTTMAN R.D., KLASSEN J., KNAACK J. — A controlled sequential morphologic study of hyperacute cardiac allograft rejection in the rat. Lab. Invest ., 1975, 33 , 280-286.

[8] BATTLE T., ARNAL J., CHALLAH M., MICHEL J.B. — Selective isolation of rat aortic wall layers and their cell types in culture ; application to converting enzyme measurement. Tissue Cell, 1994, 26 , 943-955.

[9] PLISSONNIER D., AMICHOT G., LECAGNEUX J., DURIEZ M., GENTRIL D., MICHEL J.B. — Additive and synergistic effects of low molecular weight heparin-like molecule and low doses of cyclosporin in preventing arterial graft rejection in rats. Arterioscler. Thromb ., 1993, 13 , 112-119.

[10] PLISSONNIER D., NOCHY D., MANDET C., HINGLAIS N., BARIETY J., MICHEL J.B. — Sequential immunological targeting of chronic experimental arterial allografts. Transplantation, 1995, 60 , 414-424.

[11] BOJAKOWSKI K., RELIGA P., BOJAKOWSKA M., HEDIN U., GACIONG Z., THYBERG J. — Arterioscleriosis in rat aortic allografts : early changes in endothelial integrity and smooth muscle phenotype. Transplantation, 2000, 70 , 65-72.

[12] NIEUWENHUIS P., HILLEBRANDS J.L., ROZING J. — Chronic allograft rejection associated vasculopathy and synthetic biodegradable vascular grafts : a lesson to learn ? Crit. Rev.

Immunol ., 2000, 20 , 85-88.

[13] JOHNSON T.R., TOMASZERVSKI J.E., CARPENTER J.P. — cellular repopulation of human vein allograft bypass grafts. J. Vasc. Surg., 2000, 31 , 994-1002.

[14] SHIMIZU K., SUGIYAMA S., AIKAWA M., FUKUMOTO Y., RABKIN E., LIBLY P., MITCHELL R.N. — Host bone marrow cells are a source of donor intimal smooth muscle like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Circulation, 2000, 102 , 11-221 (A1073).

[15] KOLB F., HEUDES D., MANDET C., PLISSONNIER D., OSBORNE-PELLEGRIN M., BARIETY J., MICHEL J.B. — Presensitization accelerates allograft arterioscleriosis. Transplantation, 1996, 62, 1401-1410.

[16] PLISSONNIER D., HENAFF M., PONCET P., PARIS E., TRON F., THUILLIEZ C., MICHEL J.B. — Involvement of antibody-dependent apoptosis in graft rejection. Transplantation, 2000, 69 , 2601-2608.

[17] SAMBHARA S.R., MILLER R.G. — Programmed cell death of T cells signaled by the T cell receptor and the alpha 3 domain of class 1 MHC. Science, 1991, 252, 1424-1427.

[18] GOMES D., LOUEDEC L., PLISSONNIER D., DAUGE M.C., HENIN D., OSBORNE-PELLEGRIN M., MICHEL J.B. — Endoluminal smooth muscle cell seeding limits intimal hyperplasia. J. Vasc.

Surg , soumis pour publication.

DISCUSSION

M. Yves GROSGOGEAT

Les phénomènes cellulaires et humoraux décrits ici sont-ils analogues aux phénomènes responsables de la resténose après angioplastie coronaire ? Autrement dit, les agressions mécanique et immunologique relèvent-elles d’un mécanisme voisin ?

Les types d’agressions se ressemblent par le fait qu’ils induisent des réponses cellulaires et moléculaires dans la paroi artérielle correspondant à un phénomène de cicatrisation :

prolifération intimale de cellules musculaires lisses, fibrose adventicielle (interstitielle dans les organes pleins). Ce qui est important dans le rejet chronique c’est que ces processus de cicatrisation sont en rapport avec le recrutement de cellules effectrices provenant du receveur. Ces cellules effectrices proliférantes provenant du receveur contrastent avec les cellules du donneur, cibles du rejet chronique, qui disparaissent.

M. Jacques-Louis BINET

Quelles sont les immunoglobulines en cause ? Quel est le rôle des CD4 dans ce rejet ?

Pouvez-vous préciser la technique d’ensemencement ?

Les immunoglobulines participant au rejet chronique sont des IgG. Le rôle des CD4 est d’orienter la maturation de la réponse immune vers la réponse humorale dans le rejet chronique. La technique d’ensemencement consiste à cathétériser un segment artériel, à l’isoler quelle que soit la méthode (ballons gonflables, cathéters à double cylindre… ) et à injecter les cellules au contact de la paroi. Les cellules musculaires lisses adhèrent en 10 minutes à la paroi.

M. Jean NATALI

Je voudrais rappeler les travaux expérimentaux de Jacques Oudot et Paulette GauthierVillars, effectués il y a 50 ans dans le service de Monsieur Mondor à La Salpêtrière sur les allogreffes artérielles, auxquels j’avais eu la chance d’être associé. Ils avaient bien retrouvé la disparition des cellules musculaires lisses de la média. En revanche, la prolifération intimale était loin d’être constante. De plus, ces modifications n’empêchaient pas la « greffe » artérielle de remplir son rôle de substitutif artériel et celà aussi bien sur le plan clinique qu’expérimental puisque j’ai pu suivre pendant de longues périodes (plus de 10 ans) des patients que Jacques Oudot avait opérés ainsi que des chiens porteurs de greffe artérielle.

Actuellement d’ailleurs, les allogreffes artérielles sont utilisées avec succès comme substituts artériels pour remplacer des prothèses infectées, sans qu’il soit nécessaire de pratiquer, chez ces patients, un traitement immuno-suppresseur. Comme vous nous l’avez démontré, la raison en est que le processus de rejet s’arrête avec la destruction cellulaire. Pouvez-vous nous le confirmer ?

Les travaux de Jacques Oudot ont été precurseurs dans l’allogreffe artérielle. Dans l’allo-rejet chronique, seules les cellules sont antigéniques car porteuses des complexes majeurs d’histocompatibilité ; la matrice extracellulaire ne l’est pas. Plus un tissu est riche en matrice et pauvre en cellules moins les conséquences du rejet chronique seront visibles (aorte) ; inversement plus un tissu est riche en cellules fonctionnelles et pauvre en matrice, plus le rejet chronique sera important (cœur). Le rejet chronique cesse lorsque toutes les cellules allogéniques ont disparu laissant sur place une cicatrice proliférative et fibreuse provenant du receveur. Celle-ci peut être limitée et fonctionnellement bien tolérée comme au niveau aortique, ou bien incompatible avec la fonction portée par les cellules greffées (myocytes cardiaques).

M. René KÜSS

Pensez-vous alors que ces lésions artérielles avaient une part de responsabilité lors du rejet d’une hémogreffe rénale ?

Le phénomène de rejet chronique ne touche pas seulement les artères, il touche progressivement toutes les cellules porteuses du complexe majeur d’histocompatibilité. De ce fait, les lésions artérielles ne sont qu’un aspect du rejet chronique au niveau du rein. La disparition des cellules épithéliales et leur remplacement par une fibrose interstitielle sous-tend le rejet chronique du rein.

Bull. Acad. Natle Méd., 2001, 185, no 3, 605-613, séance du 27 mars 2001