ALTÉRATIONS MITOCHONDRIALES DANS L’APOPTOSE

La mort cellulaire programmée, aussi appelée « apoptose », joue un rôle fondamental dans le développement et l’homéostasie des tissus et sa dérégulation est impliquée dans de nombreuses maladies. Ainsi, l’impossibilité d’entrer en apoptose peut participer à la transformation maligne (oncogenèse) et au développement des chimiorésistances. Des mutations dans des gènes qui contrôlent l’apoptose (notamment p53 et bcl-2 ) sont impliquées dans la pathogénie de la majorité des néoplasies malignes humaines. Mon laboratoire s’est intéressé aux mécanismes fondamentaux de l’apoptose depuis son établissement à Villejuif en novembre 1993. À partir de l’hypothèse selon laquelle des événements cytoplasmiques (non nucléaires) devraient occuper la phase précoce de l’apoptose, nous avons recherché des altérations biochimiques définissant la pré-apoptose. Nous avons trouvé qu’une réduction dans l’incorporation de fluorochromes lipophiles cationiques (JC-1, DIOC6(3), CMXRos) se distribuant dans les cellules en fonction du potentiel de membrane mitochondriale (∆Ψm), permet de détecter l’apoptose des lymphocytes induite in vivo [1, 2]. Il semble que cette altération de la fonction mitochondriale soit une caractéristique commune de l’apoptose, indépendamment du stimulus inducteur et du type cellulaire concerné [1, 2], même lorsque le stimulus n’est pas physiologique comme dans le cas des chimiothérapies ou de l’infection par le VIH [3]. L’inhibition de la première étape de la pré-apoptose (chute du ∆Ψm) par la ciclosporine A ou un dérivé non-immunosuppressif de la ciclosporine A, la N -méthyl-4-Val-ciclosporine

A ou encore l’acide bongkrékique (un ligand du translocateur de nucléotides à adénine, TNA) 84, [4, 5] nous a permis de faire le lien avec un phénomène mitochondrial inhibé de manière spécifique par ces substances : la transition de perméabilité.

L’inhibition de celle-ci prévient toutes les altérations de l’apoptose au niveau de la
membrane plasmique (exposition aberrante de résidus de phosphatidylsérine), du cytoplasme (activation des caspases, perte de glutathion, oxydation de membranes cellulaires, vacuolisation, augmentation du Ca2+, perte de K+) et du noyau (condensation de la chromatine et fragmentation de l’ADN) [5]. La transition de perméabilité s’avérait donc déterminante pour l’entrée en apoptose.

MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE LA PERMÉABILISATION DES MEMBRANES MITOCHONDRIALES

Le pore responsable de la transition de perméabilité est un ensemble multiprotéique dynamique qui se forme par l’apposition de protéines des membranes mitochondriales interne et externe dans les sites de contact entre celles-ci. Nous sommes parvenus à purifier ce pore, ce qui nous a permis de démontrer que celui-ci contient plusieurs protéines transmembranaires (au niveau de la membrane externe, la porine mitochondriale, et au niveau de la membrane interne, le translocateur de nucléotides à adénine, TNA), ainsi que certaines protéines solubles du cytosol (hexokinase) et de la matrice mitochondriale (cyclophiline D). Nous avons optimisé un protocole permettant la reconstitution du pore de TP purifié dans des liposomes artificiels, suivie par la quantification de l’ouverture/clôture du pore de TP, qui altère la perméabilité des membranes liposomales [6]. La caractérisation biochimique et fonctionnelle de ces liposomes a démontré des similitudes entre les liposomes contenant le pore de TP et le comportement du pore de TP naturel se trouvant dans la mitochondrie. Ainsi, leur régulation par des caspases, des pro-oxydants, le calcium, les ligands du TNA et certains membres de la famille Bcl-2 est à peu près comparable [6]. Il semblait donc que le pore de TP soit lui-même la cible de nombreux inducteurs de l’apoptose. Cette découverte a constitué une étape cruciale pour l’exploration de la régulation de l’apoptose, étant donné qu’elle permettait de réduire la complexité du système expérimental à l’étude d’un ensemble polyprotéique. Nous avons observé que la protéine Bax est co-purifiée avec le pore de TP de cerveau. L’élimination de Bax (une protéine pro-apoptotique) par immunodéplé- tion ou invalidation génique ( knock-out ) altère le comportement fonctionnel du pore de TP, qui devient plus résistant à l’ouverture induite par certains ligands du TNA [7]. Des expériences de co-immunoprécipitation et de système à doublehybride chez la levure ont confirmé l’interaction physique entre le TNA et Bax. La protéine Bcl-2 recombinante (qui est anti-apoptotique) a un effet inhibiteur direct sur le pore de transition de perméabilité reconstitué dans les liposomes [7]. Cette activité inhibitrice sur le pore reconstitué montre une étroite corrélation avec l’activité anti-apoptotique ; des mutations abolissant l’effet cytoprotecteur de Bcl-2 annulent aussi son effet sur le pore de transition de perméabilité reconstitué [7, 8]. La protéine Bcl-XL, un homologue de Bcl-2 inhibant également l’apoptose, fonctionne aussi comme inhibiteur du pore de transition de perméabilité [7], alors que la protéine pro-apoptotique Bid, membre de la famille Bcl-2, peut avoir l’effet contraire [9]. Récemment, nous avons trouvé que la protéine Vpr codée par le VIH-1
interagit spécifiquement avec le TNA, avec une affinité nanomolaire, ce qui lui permet d’interagir avec les membranes mitochondriales, de les perméabiliser et de tuer les cellules [10, 11].

Nous avons amorcé l’étude de plusieurs substances cytotoxiques utilisées en chimiothérapie afin de clarifier leur mode d’action. Alors qu’un certain nombre de substances utilisées dans le traitement des cancers (doxorubicine, étoposide, cis -platine) [12] n’ont pas d’effet direct sur les mitochondries, d’autres agents expérimentaux (arsénite, lonidamine, acide bétulinique, diamide, PK11195) exercent des effets directs sur les mitochondries et sur le pore de transition de perméabilité reconstitué [12-16]. De manière remarquable, il semble que le pore de transition reconstitué soit régulé par Bcl-2 de la même façon que dans les cellules. La protéine recombinée Bcl-2 inhibe l’ouverture du pore de transition de perméabilité isolée en réponse à l’arsénite, à la lonidamine, à l’acide bétulinique et au stress oxydatif ; la transfection de cellules avec le gène bcl-2 a un effet cytoprotecteur face à ces mêmes agents [13-15]. En revanche, Bcl-2 n’a pas d’effet inhibiteur, ni sur le pore de transition de perméabilité purifié, ni sur les cellules, lorsqu’on utilise la diamide (un agent provoquant l’oxydation de thiols voisins) ou des caspases comme inducteurs de l’apoptose [16]. Nous avons observé que PK11195, une isoquinoline se fixant sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, neutralise l’effet inhibiteur de Bcl-2 sur l’ouverture du pore de transition de perméabilité dans les mitochondries isolées et simultanément abolit son effet cytoprotecteur [13]. Il semble que d’autres molé- cules puissent aussi agir directement sur les membranes mitochondriales : le CD437, un dérivé de rétinoïde [17], et la verteporfine, un photosensibilisateur [18].

CARACTÉRISATION DES PROTÉINES APOPTOGÈNES MITOCHONDRIALES

Notre équipe a montré que, pendant la phase décisive du processus apoptotique et en réponse à divers stimuli, les mitochondries relarguent de l’espace intermembranaire plusieurs protéines apoptogènes [4, 19, 20]. Parmi les facteurs identifiés à ce jour, on peut citer le cytochrome c, certaines caspases (notamment les caspases 2 et 9), une DNase et un facteur inducteur de l’apoptose nommé AIF [21]. Les trois derniers facteurs ont été mis en évidence dans notre laboratoire. Nous avons cloné et identifié l’AIF qui a la particularité d’induire directement l’apoptose nucléaire lorsqu’il est ajouté à des noyaux purifiés [22]. La séquence d’AIF est fortement conservée entre différentes espèces de mammifères et possède une forte homologie dans sa partie carboxy-terminale (aa 128 à 613 d’AIF humain et aa 127 à 612 d’AIF murin) avec de nombreuses NADH oxydoréductases d’eubactéries et d’archaebactéries. La partie amino-terminale correspond à une séquence d’adressage mitochondrial [23]. La protéine AIF mature (qui est une flavoprotéine) est relarguée des mitochondries suite à la perméabilisation de la membrane externe. Le fractionnement subcellulaire, l’analyse en immunofluorescence et l’immunodétection en microscopie électronique confirment que l’AIF est exclusivement présent dans
l’espace intermembranaire mitochondrial des cellules intactes [22, 24]. Cependant, après induction de l’apoptose, il y a translocation de l’AIF de la mitochondrie vers le cytosol et le noyau. Cette redistribution est concomitante à la baisse du ∆Ψm ; elle est suivie de la condensation chromatinienne [25]. Lorsque l’AIF recombiné est ajouté à des noyaux isolés de cellules HeLa, il provoque une condensation chromatinienne accompagnée d’une digestion de l’ADN en fragments de haut poids moléculaire (50 Kbp) [22, 26]. La micro-injection d’AIF recombinante dans des cellules intactes provoque tous les signes classiques de l’apoptose, notamment la condensation chromatinienne, la dissipation du ∆Ym et l’exposition des phosphatidylsérines à la surface cellulaire [22]. Ces effets sont indépendants des caspases. La co-injection d’un anticorps spécifique anti-AIF permet de prévenir tous les signes apoptotiques, au moins dans certains modèles [27]. Mon équipe a pu éclaircir la relation entre les protéines de la famille Bcl-2 et AIF. En empêchant l’ouverture du pore de TP, Bcl-2 supprime la libération des facteurs apoptogènes mitochondriaux (y compris AIF et les caspases 2 et 9) [19, 21, 22]. En revanche, Bcl-2 n’affecte pas la synthèse d’AIF ni son action sur le noyau ; il perd donc sa capacité d’empêcher l’apoptose si le relargage d’AIF est provoqué artificiellement [19, 22]. La surexpression d’AIF suite à une transfection suffit pour induire l’apoptose, même dans des conditions dans lesquelles les caspases sont inhibées et Bcl-2 surexprimé [23].

AIF est donc un inducteur dominant de l’apoptose qui peut agir au-delà de toute régulation (FASEB J ., sous presse).

AIF est exprimé de manière ubiquitaire, y compris pendant le développement embryonnaire. Le phénotype du knock-out d’AIF a été étudié. La létalité précoce causée par cette invalidation au stade embryonnaire murin, par défaut de l’étape de cavitation lors de la différentiation endo- et ectodermique, a pu être attribuée à un défaut d’apoptose de cellules à l’intérieur du corps embryoïde (ce qui est d’une importance majeure car c’est la première fois qu’il est montré qu’un facteur apoptotique est impliqué à ce stade de l’embryogenèse). Il s’avère donc que AIF est indispensable pour la première vague d’apoptose survenant pendant le développement embryonnaire de la souris [28]. L’importance physiologique d’AIF pour la régulation de l’apoptose est donc établie.

PERSPECTIVES

Les résultats de nos travaux ont des retombées importantes, étant donné qu’ils contribuent à éclaircir les mécanismes fondamentaux de l’un des processus biologiques les plus importants : l’apoptose ou mort cellulaire programmée. D’une certaine manière, il est concevable que la perméabilisation de la membrane mitochondriale (PMM) est à l’apoptose ce qu’est la régulation du cycle cellulaire à la prolifération [29]. Cette hypothèse reste néanmoins à vérifier dans sa généralisation. De plus, nos résultats ont élucidé le mode d’action subcellulaire de l’un des proto-oncogènes les plus importants, bcl-2 , qui est hyperexprimé à peu près dans la moitié des cancers humains [30]. Ils ont également élucidé le mode d’action moléculaire du gène
suppresseur de tumeurs bax (qui contribuerait à la survie des patientes atteintes de cancer du sein) . Cette découverte devra faciliter le développement de médicaments destinés à neutraliser l’effet anti-apoptotique (oncogénique) de

Bcl-2 ou à mimer l’effet de

Bax . Nos résultats suggèrent la possibilité de cibler les membranes mitochondriales afin d’induire l’apoptose. En effet, plusieurs agents cytotoxiques utilisés en chimiothérapie expérimentale agissent directement sur des protéines mitochondriales et induisent la PMM [12], ce qui permet d’entrevoir la possibilité de rechercher activement de nouveaux agents anticancéreux ayant ce mécanisme d’action.

Finalement, nous avons développé une stratégie d’induction de la mort cellulaire au-delà de toute régulation, par surexpression de la protéine AIF [23]. Il reste à explorer si cette dernière stratégie pourra être exploitée au niveau de la thérapie génique ou mimée au niveau pharmacologique.

REMERCIEMENTS

Je voudrais remercier les différents membres de mon équipe 1994-2001 (Anne-Sophie Belzacq, Patricia Boya, Catherine Brenner, Maria Castedo, Isabelle Cohen, Paola Costantini, Bruno Dallaporta, Eric Daugas, Didier Decaudin, Manuel de Pablo, Chahrazed El Hamel, Karine Ferri, Simone Fulda, Delphine Haouzi, Tamara Hirsch, Sonsoles Hortelano, Etienne Jacotot, Nathanael Larochette, Antonio Macho, Carine Maisse, Philippe Marchetti, Isabel Marzo, Didier Métivier, Cristina Muñoz, Patrice X. Petit, Luigi Ravagnan, Maria Rita Rippo, Thomas Roumier, Santos A. Susin, Helena L.A. Vieira, Naoufal Zamzami) ainsi que les nombreux collaborateurs externes d’avoir contribué à cette aventure collective. Nos projets ont été soutenus par l’ANRS, l’ARC, le CNRS, la Commission Européenne, la Fondation de France, la FRM, l’IGR, la Ligue contre le Cancer, le Ministère de Recherche. Le montant global du Prix Gallet et Breton de l’Académie nationale de médecine a été donné au CNRS afin de financer les activités de l’équipe.

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DISCUSSION

M. Jacques-Louis BINET

Vous avez montré l’importance des mitochondries dans le processus d’apoptose. Quand vous avez étudié le rôle des chimiothérapies sur les mitochondries, qu’avez-vous observé pour les alkylants et le flavoprinidol 2 où agit la PJ3 ?

Parmi les substances que vous mentionnez nous n’avons étudié que certains agents alkylants, notamment la cyclophosphamide, la melphalane et le chlorambucil.

Lorsqu’on rajoute ces agents aux mitochondries purifiées, on n’observe pas d’effet perméabilisateur. Néanmoins, les cellules intactes exposées à ces agents manifestent les signes d’une perméabilisation mitochondriale. Nous en avons conclu que les agents alkylants stimulent la voie mitochondriale de l’apoptose de manière indirecte, en élicitant la production de messagers secondaires endogènes, qui eux agiraient sur les mitochondries.

M. Louis DOUSTE-BLAZY

Le monoxyde d’azote, suivant sa concentration, modifie la perméabilité mitochondriale, l’activant ou l’inhibant et agissant sur les caspases. Les protéines que vous avez décrites interviennent-elles et comment ?

Nous avons utilisé le monoxyde d’azote (NO) dans un modèle d’induction de l’apoptose et nous avons obtenu des évidences suggérant que le NO agit en activant la voie mitochondriale de l’apoptose. La surexpression de la protéine Bcl-2, qui stabilise les membranes mitochondriales, protège contre l’effet cytotoxique/apoptogène de NO. De plus, la protéine VMIA, Viral Mitochondrial Inhibitor of Apoptosis (codé par le cytomé- galovirus), une protéine interagissant spécifiquement avec la translocase de nucléotides à adénine (TNA) de la membrane interne de la mitochondrie, neutralise l’effet cytocide de NO. Des protéoliposomes deviennent susceptibles à l’effet perméabilisateur de NO lorsqu’ils contiennent de la TNA, effet qui est antagonisé par la protéine recombinante Bcl-2. Nous concluons de ces expériences qu’une des cibles responsables de l’effet apoptogène de NO pourrait être la TNA .

Bull. Acad. Natle Méd., 2001, 185, no 6, 1135-1143, séance du 26 juin 2001