Communication scientifique
Session of 27 mars 2007

Aspects virologiques et carcinologiques des papillomavirus humains (HPV)

MOTS-CLÉS : human papillomavirus . papillomaviridae. protéines e7 des papillomavirus. protéines oncogènes virales.
Virological and carcinogenic aspects of HPV
KEY-WORDS : human papillomavirus . oncogene proteins viral.. papillomaviridae. papillomavirus e7 proteins

Jean-Luc Prétet, Jean-François Charlot, Christiane Mougin

Résumé

Les papillomavirus humains (HPV) sont de petits virus nus, appartenant à la famille des Papillomaviridae . Plus de cent représentants sont aujourd’hui identifiés qui sont responsables de lésions cutanées ou muqueuses, bénignes ou malignes. A ce titre, les HPV du genre alpha dits à bas risque (HPV6, 11) sont à l’origine des condylomes externes génitaux, et les HPV à haut risque (HPV16 ou 18) sont responsables des lésions précancéreuses et cancéreuses du col de l’utérus. Le matériel génétique comporte plusieurs phases ouvertes de lecture codant des protéines impliquées dans la réplication de l’ADN viral (E1 et E2), dans la régulation de l’expression des gènes viraux (E2), dans la formation des virions (E4) et dans l’immortalisation et la transformation cellulaire (E5, E6, E7) pour les HPV à haut risque seulement. Les phases ouvertes de lecture L1 et L2 codent les protéines de la capside. Les HPV infectent les cellules souches des épithéliums. Un cycle de multiplication complet des HPV comporte 3 phases qui, suite à l’expression séquentielle des gènes viraux, permettent la réplication de l’ADN viral puis la production de nouveaux virions infectieux. L’intégration de l’ADN viral ne concerne que les HPV à haut risque. Cela conduit à une surexpression des deux oncoprotéines virales E6 et E7 dont l’action combinée à celle de E5 favorise l’immortalisation et la transformation cellulaires.

Summary

Human papillomaviruses are small viruses belonging to the Papillomaviridae . More than 100 genotypes have been identified, causing benign (low-risk HPV) or malignant (highrisk HPV) cutaneous or mucosal lesions. The low-risk HPV6 and HPV11 provoke genital warts, while the high-risk HPV16 and HPV18 can cause cervical cancer. The HPV genome includes several open reading frames that encode proteins involved in viral DNA replication (E1 and E2), viral gene expression regulation (E2), virus assembly (E4) and the immortalisation and transformation of infected epithelial cells (E5, E6 and E7 ; high-risk HPV only). The open reading frames L1 and L2 encode the two capsid proteins. HPV target stem cells of the squamous epithelium. The complete life cycle involves three phases, with sequential expression of viral genes leading to viral DNA replication and to the production of highly infectious virions. Viral DNA integration occurs with high-risk types and leads to the overexpression of two viral oncoproteins, E6 and E7. These proteins, in combination with E5, promote the immortalisation and transformation of infected cells.

LES

PAPILLOMAVIRIDAE : UNE NOUVELLE FAMILLE DE VIRUS

Les papillomavirus humains appartiennent à la famille des

Papillomaviridae qui comprend 118 représentants [1]. Compte tenu de l’identification d’un nombre conséquent de séquences partielles de papillomavirus, nous pouvons estimer qu’une centaine de génotypes supplémentaires existe. Ces virus, mis en évidence dès les années 1970 par des techniques moléculaires [2-4] sont ubiquitaires, très anciens et très stables. Des papillomavirus infectent le lapin, le chien, le bœuf, le singe. La majeure partie des papillomavirus identifiés (96 génotypes) infecte l’espèce humaine (nous les désignons alors papillomavirus humains ou HPV pour Human PapillomaVirus). Ce sont tous des virus épithéliotropes qui sont responsables, sur le plan clinique, de tumeurs bénignes ou malignes.

LA CLASSIFICATION DES PAPILLOMAVIRIDAE

La classification des

Papillomaviridae repose sur des identités de séquence nucléotidique codant la protéine majeure de capside L1. Il existe seize genres possédant moins de 60 % d’identité et qui sont désignés par une lettre grecque ( alpha à pi ). Ces genres se subdivisent en espèces qui présentent 60 à 70 % d’identité. Elles sont numérotées à l’aide d’un chiffre arabe. Au sein des espèces, il apparaît des types de papillomavirus qui partagent entre 71 et 89 % d’identité. Nous distinguons ensuite des sous-types qui présentent une différence de 2 à 10 % par rapport au type et des variants dont la différence n’excède pas 1 à 2 % [1].

Cette classification qui répond aux exigences des taxonomistes reflète parfois les propriétés biologiques des papillomavirus mais de nombreuses exceptions subsistent. D’un point de vue pratique, il est classique de différencier les HPV muqueux des HPV cutanés en fonction du site préférentiel de développement des lésions qui leurs sont associées. Par ailleurs, les génotypes responsables des lésions bénignes sont dits à bas risque alors que les génotypes responsables des lésions cancéreuses sont dits à haut risque. Ainsi, les HPV1 et 2 sont des HPV à bas risque responsables de verrues plantaires ou palmaires, alors que les HPV5 et 8, du genre bêta sont des

HPV à haut risque car ils sont retrouvés constamment dans les cancers cutanés non mélaniques chez des patients atteints d’une génodermatose rare, l’épidermodysplasie verruciforme (EV). Cette dichotomie concernant les propriétés oncogéniques des HPV cutanés est retrouvée parmi les HPV à tropisme muqueux : les HPV6 et 11 sont à bas risque car ils sont responsables de condylomes génitaux externes alors que les HPV16 et 18 sont les principaux génotypes responsables des cancers du col utérin en particulier.

L’ORGANISATION STRUCTURALE ET GENOMIQUE DES PAPILLOMAVIRUS EST SIMPLE

Sur le plan structural, les papillomavirus sont de petits virus (52 à 55 nm de diamètre) dont la capside est organisée selon une symétrie icosaédrique. Les 72 capsomères qui constituent cette capside sont composés des protéines L1 et L2. Ce sont des virus non enveloppés qui résistent très bien dans l’environnement.

Les papillomavirus possèdent un génome constitué d’un ADN double brin circulaire d’environ 8 000 paires de bases (fig. 1). Le nombre de séquences codantes est variable en fonction des génotypes ; elles sont toutes regroupées sur le même brin d’ADN. L’ADN des HPV comporte six phases ouvertes de lectures (POL) codant les protéines précoces qui sont dénommées E pour « Early ». Deux POL codent les protéines tardives L1 et L2 (L pour « Late »). Lorsque la POL L1 est exprimée in vitro , seule ou en association avec L2, les protéines correspondantes s’autoassemblent en pseudo-particules virales (ou VLP pour « Virus Like Particles ») dont la morphologie et les propriétés antigéniques sont similaires à celles des virions natifs.

Ces pseudo-particules virales sont à la base des vaccins prophylactiques actuels qui montrent une excellente efficacité clinique [5, 6]. Une troisième région non codante est présente. Elle est nécessaire au contrôle de la réplication de l’ADN viral et possède les promoteurs de la transcription des gènes précoces. Elle est appelée LCR pour « Long Control Region ».

LE CYCLE DE MULTIPLICATION VIRALE COMPLET DEPEND DE LA DIFFERENCIATION CELLULAIRE

Les cellules cibles des papillomavirus humains sont vraisemblablement les cellules souches des épithéliums malpighiens. Au niveau du col de l’utérus, les HPV accèdent à ces cellules soit au profit de microlésions de l’épithélium, soit directement au niveau de la zone de transformation entre l’épithélium malpighien de l’exocol et l’épithélium glandulaire de l’endocol. Les différentes étapes du cycle complet de multiplication sont étroitement liées à la différenciation des cellules épithéliales (fig. 2).

FIG. 1. — Représentation schématique de l’organisation du génome de l’HPV16.

FIG. 2. — Le cycle de multiplication virale des HPV. Dans le cas du col utérin, les HPV peuvent accéder à leurs cellules cibles directement au niveau de la zone de transformation, site de rencontre entre l’epithélium glandulaire de l’endocol et l’épithélium malpighien de l’exocol ou via une microlésion présente au niveau de l’épithélium malpighien. Le génome viral se réplique sous forme épisomale dans le noyau des cellules épithéliales. Au cours de la différenciation cellulaire, le génome viral s’amplifie, puis l’expression des protéines tardives L1 et L2 est activée.

Cette phase productive est à l’origine de la production de nouveaux virions infectieux qui sont libérés dans le milieu extérieur au fur et à mesure de la desquamation des cellules épithéliales.

L’entrée cellulaire est réalisée par endocytose

Les mécanismes d’entrée cellulaire et de trafic intracellulaire des papillomavirus ont été élucidés en partie grâce à l’utilisation des pseudo-particules virales. L’interaction virus-cellules fait intervenir plusieurs récepteurs parmi lesquels des héparanes sulfates serviraient à la fixation des virus au niveau de la membrane cellulaire [7-9].

Par ailleurs, une intégrine favoriserait l’entrée à proprement parler. Récemment, il a été montré qu’une protéine de la lame basale, la laminine 5, pouvait piéger des pseudo-particules virales ou des virions natifs. Comme cette protéine est un ligand des intégrines (l’intégrine alpha 6), elle faciliterait l’interaction entre les papillomavirus et les cellules cibles exprimant cette intégrine [10]. Les mécanismes d’endocytose qui suivent la fixation sont propres à chaque génotype [11]. Le trafic intracellulaire des virions est assuré par les protéines du cytosquelette (microtubules et/ou microfilaments d’actine) jusqu’à proximité du noyau où l’ADN viral subit une décapsidation. C’est l’ADN associé à des capsomères qui est alors transloqué dans le noyau à l’aide de karyophérines.

La réplication de l’ADN viral s’effectue en trois phases

La première phase de la réplication de l’ADN viral est la phase d’établissement.

Elle se déroule dans les cellules souches de l’épithélium et les protéines précoces E1 et E2 agissent en synergie pour activer la réplication. Ceci a lieu lors de la phase S du cycle cellulaire au cours de laquelle l’ensemble des protéines cellulaires de duplication de l’ADN est présent. La protéine E2, par un mécanisme d’encombrement stérique, limite l’expression des protéines E6 et E7 à des taux permettant toutefois une perturbation du cycle cellulaire, ce qui a pour effet de maintenir les cellules en cycle.

La deuxième phase est appelée phase de maintenance. Elle est caractérisée par le fait qu’un nombre constant de copies d’ADN viral est présent dans les cellules au fur et à mesure de leur division. Cette étape se déroule dans les cellules basales et parabasales de l’épithélium et c’est grâce à E2 que la ségrégation des génomes viraux est assurée de façon correcte [12]. A ce stade, il n’y a toujours pas de production de nouveaux virions.

La troisième phase est dite d’amplification. Elle est associée à la production de nouveaux virus. Vraisemblablement par un mécanisme de réplication de type « en cercle roulant », le nombre de génomes viraux est largement augmenté dans chaque cellule [13]. De façon concomitante, et ce dans les cellules épithé- liales les plus différenciées, l’expression des POL L1 et L2 est activée par des facteurs cellulaires qui ne sont toutefois toujours pas identifiés. L’encapsidation des génomes viraux a lieu et les nouvelles particules virales infectieuses sont libérées dans le milieu extérieur au rythme des desquamations cellulaires. La muqueuse devient très infectante et le risque de transmission à un partenaire est important. Cette infection virale productive se traduit par un effet cytopa-
thogène pathognomonique de l’infection à HPV caractérisé par des koïlocytes [14].

Le maintien des cellules en prolifération est essentiel à l’accomplissement d’un cycle complet de multiplication des HPV. Pour ce faire, les protéines E6 et E7 des HPV, bien que faiblement exprimées au cours du cycle viral, inactivent les protéines à poche p105Rb, p107 et p130 et la protéine p53 [15].

CLAIRANCE ET LATENCE

Les HPV à bas risque sont en général éliminés plus rapidement (en quatre à six mois environ) que les HPV à haut risque (en douze à seize mois environ). Puis, l’acquisition d’une immunité spécifique doit empêcher toute réinfection par un même génotype. Toutefois, il n’est pas exclu que le virus puisse persister à l’état latent.

Cette hypothèse est supportée par l’identification, dans un modèle cellulaire, d’un petit transcrit de fusion E8ÙE2C dont l’expression est associée à une inhibition de la réplication de l’ADN viral [16]. Dans ce cas, l’ADN viral qui reste sous forme épisomale n’est pas détecté. La réplication peut être réactivée à la suite d’un épisode d’immunodépression par exemple.

LE MECANISME DE CARCINOGENESE EST ASSOCIE À L’INTEGRATION DE L’ADN DES HPV A HAUT RISQUE

L’intégration concerne uniquement l’ADN des HPV à haut risque

La majorité des cancers invasifs comporte des séquences d’ADN d’HPV intégrées au génome de la cellule hôte. L’intégration est un évènement « terminal » dans le cycle de vie du virus car aucune réplication/multiplication virale ne sera possible par la suite. L’infection est alors abortive. En revanche, il s’agit d’une étape importante dans la progression vers le cancer. L’intégration peut être un phénomène précoce survenant dès les stades pré-cancéreux et des études récentes menées dans notre laboratoire montrent que des formes intégrées existent dans les tissus normaux abritant des HPV.

L’étude de l’intégration, à partir de lésions anogénitales, a montré que l’ADN viral était fréquemment clivé au niveau des POL E1 et E2. La rupture de la POL E2 entraîne une perte d’expression de la protéine E2 qui n’exerce plus son effet transinhibiteur sur les promoteurs précoces. Ceci conduit à une surexpression des protéines E6 et E7 et à une augmentation des capacités d’immortalisation de l’HPV16 [17]. Plusieurs expériences confirment que l’inactivation des gènes E1 et E2 est corrélée à un pouvoir transformant de différents types d’HPV à haut risque [17, 18]. Cependant, des travaux ont démontré que la rupture de la POL E2 lors de l’intégration ne serait pas essentielle pour expliquer l’augmentation d’expression de

E6 et E7. Des dérégulations post-transcriptionnelles ainsi que des mutations de la POL E2 modifiant l’activité de la protéine ont été observées dans des échantillons de cancer du col utérin. L’expression dérégulée de E6 et E7 entraîne une instabilité génomique qui se manifeste par des aberrations dans la duplication des centrosomes et des translocations chromosomiques [19].

L’intégration de l’ADN viral dans le génome cellulaire se fait généralement au hasard, en privilégiant toutefois les sites fragiles. Il a été décrit des intégrations à proximité de proto-oncogènes (TP63, NR4A2, APM-1, TNFAIP2 et hTERT), le site le plus fréquent étant la bande chromosomique 8q24 dans laquelle se localise c-myc [20-22]. La mutagenèse insertionnelle est très rare mais une intégration du génome viral dans un anti-oncogène cellulaire a déjà été décrite et un tel phénomène peut contribuer au processus d’immortalisation [23].

Trois protéines virales sont considérées comme des oncogènes

Les protéines E5, E6 et E7 sont les principales protéines possédant des propriétés oncogéniques. L’essentiel des données concernent les HPV à haut risque du genre alpha mais une place de plus en plus importante est faite aux HPV du genre bêta (fig. 3).

La protéine E6 possède deux doigts de zinc très conservés et essentiels à sa fonctionnalité et un domaine de liaison aux protéines à domaines PDZ. De très nombreux partenaires de E6 sont décrits ce qui lui confère un nombre consé- quent de fonctions.

La première cible de E6 à avoir été décrite est la protéine gardien du génome p53.

Dans plus de 50 % des cancers humains, p53 est mutée. Ce n’est pas le cas dans les cancers associés aux HPV où elle demeure sauvage, mais sa demi-vie est très largement diminuée. En effet, en association avec l’ubiquitine ligase E6AP (E6 Associated Protein), E6 favorise l’étiquetage de p53 par des molécules d’ubiquitine : p53 est alors dégradée par le protéasome 26S. E6 a aussi la capacité de piéger p53 dans le cytoplasme de la cellule et par conséquent d’inhiber son activité transcriptionnelle nécessaire à la régulation du cycle cellulaire, à la réparation de l’ADN et à l’induction de l’apoptose. La protéine E6 interfère directement avec l’activité de protéines impliquées dans la réparation de l’ADN (MGMT, XRCC1). D’autres protéines intervenant dans l’apoptose sont des cibles de E6. Ainsi l’activation des récepteurs de mort est directement (TNF R1) ou indirectement (Fas via son adaptateur FADD) inhibée par E6. Par ailleurs, la protéine pro-apoptotique Bak est sujette à la dégradation médiée par E6 des HPV16 ou 18 mais aussi par E6 d’HPV77 ou d’HPV5 [24-26]. Ainsi, l’irradiation par des UV-B n’entraîne plus l’apoptose de cellules épidermiques d’origine humaine lorsqu’elles expriment E6 d’HPV5 [25]. Enfin, l’expression des ARNm de Bax est réduite en présence de E6 d’HPV16 et la stabilité de la protéine est diminuée [27]. Par ailleurs, E6 limite la perte des télomères normalement observée au cours des divisions cellulaires successives. Pour cela, E6 active l’expres-

FIG. 3. — Représentation des principales activités des protéines virales E5, E6 et E7 des HPV à haut risque, impliquées dans l’immortalisation et la transformation des cellules infectées.

En gras : protéines activées. Souligné : protéines inhibées.

sion de la sous-unité catalytique limitante de la télomérase, hTERT [28]. De plus, E6 favorise le processus métastatique en limitant l’adhérence des cellules à la matrice extracellulaire et en activant la production de VEGF, principal facteur responsable de l’angiogenèse [29].

La protéine E7 comporte deux motifs en doigt de zinc lui permettant de s’associer en dimères. Parmi les propriétés d’immortalisation de cette protéine, l’inactivation de la protéine de susceptibilité au rétinoblastome p105Rb joue un rôle essentiel. p105Rb est une phosphoprotéine nucléaire qui, sous forme hypophosporylée, bloque la cellule en phase G0/G1. En effet, cet état lui permet de séquestrer les facteurs de transcription de la famille E2F et d’empêcher la transactivation de leurs gènes cibles codant les cyclines E et A, la phosphatase CDC25A, l’ADN polymérase alpha , la thymidine kinase, nécessaires à la transition G1/S et à la progression dans la phase S. La protéine E7 des HPV à haut risque a une forte affinité pour la p105Rb hypophosporylée et pour les protéines apparentées p107 et p130. L’inactivation de pRb permet la libération des facteurs E2F [30, 31] ; il y a alors perte de contrôle de la transition G1/S. Il a été récemment démontré que l’activité d’immortalisation de E7 des HPV à haut risque était en partie liée à la dégradation de p105Rb par le protéasome. La protéine E7 d’HPV38 appartenant au genre bêta inactive aussi la pRb avec une efficacité similaire à celle de E7 d’HPV16 [32], alors que la protéine E7 d’HPV77 est beaucoup moins efficace [33]. Par ailleurs, la protéine E7 transactive directement les promoteurs de la cycline E et de la cycline A et neutralise les inhibiteurs de kinases dépendantes des cyclines, les CKI, p21 et p27. L’expression de E7 favorise aussi l’instabilité génomique en perturbant la duplication des centrosomes et la ségrégation des chromosomes au cours de la mitose. Il en résulte des mitoses anormales, dites multipolaires qui sont caractéristiques des lésions associées aux HPV à haut risque [34]. Récemment, Thierry et al ont mis en évidence l’activation par E7 de gènes mitotiques comme Plk ou Aurora qui contribuent à l’induction de l’instabilité génomique [35]. D’autres fonctions de E7 favorisent la progression tumorale. Ainsi, E7 est capable de moduler la mobilité cellulaire en modifiant la structure du cytosquelette [36], ou en limitant la production de fibronectine [37], indispensable à l’adhérence des cellules à la matrice extracellulaire.

— La protéine E5 est une petite protéine hautement hydrophobe. Elle s’associe aux membranes de l’appareil de Golgi, du réticulum endoplasmique, des endosomes, de l’enveloppe nucléaire et dans une moindre mesure, aux membranes cytoplasmiques. En interférant avec au moins deux types de récepteurs aux facteurs de croissance, E5 stimule la prolifération cellulaire. Ainsi, cette protéine réduit l’endocytose des complexes récepteurs de l’EGF-EGF (facteur de croissance épidermique) et limite leur dégradation dans les endosomes en inhibant les pompes à protons ; il s’ensuit un recyclage important des récepteurs à la membrane plasmique [38]. La protéine E5 du papillomavirus bovin de type 1 (BPV1) favorise la dimérisation du récepteur du PDGF bêta (facteur de croissance
dérivé des plaquettes), indépendamment du ligand. Il s’ensuit une activation du récepteur [39]. La stimulation de ces récepteurs aboutit à l’expression des protéines Fos et Jun formant le complexe AP1. Celui-ci possède un site de fixation sur le promoteur précoce des HPV et active ainsi l’expression de E6 et de E7 [40]. Les récepteurs de TRAIL et de Fas-L sont aussi des cibles de E5. Cette protéine virale, après s’être fixée à ces récepteurs, perturbe leurs modifications post-traductionnelles. Ceci rend le récepteur de TRAIL incapable de lier son ligand ou d’assurer la transduction du signal. Par ailleurs la demi-vie de Fas est très réduite, ce qui limite son expression membranaire et rend les cellules résistantes à l’apoptose médiée par Fas-L [41]. L’inhibition des communications intercellulaires via les jonctions gap est une étape précoce de la carcinogenèse ;

elle a été observée avec les protéines E5 d’HPV16 et de BPV4.

L’inactivation de p53 et de pRb par E6 et E7 respectivement permet de surmonter la première phase de mortalité et donc d’augmenter la durée de vie des cellules infectées. L’instabilité chromosomique qui résulte des anomalies de duplication des centrosomes et de ségrégation des chromosomes conduit les cellules à la deuxième phase de mortalité ou crise cellulaire. La majorité des cellules meurt. Seuls quelques clones qui échappent à la crise poursuivent leur division grâce à la réactivation de la télomérase. Puis la progression du phénotype immortel au phénotype tumorigène est associée à des altérations épigénétiques et à des pertes ou des gains chromosomiques suggérant l’implication de plusieurs oncogènes dans la carcinogenèse du col utérin [42].

CONCLUSION

Le cancer du col utérin est la conséquence ultime et rare d’une infection persistante à HPV à haut risque. L’intégration du génome viral résulte en une dérégulation de l’expression des oncoprotéines virales E6 et E7 qui interfèrent avec deux protéines clés du contrôle du cycle cellulaire p53 et pRb, conduisant à l’instabilité génétique.

L’immortalisation des cellules est associée à l’activation de la télomérase et la transformation maligne résulte d’altérations épigénétiques et génétiques supplé- mentaires.

REMERCIEMENTS

Ligue Contre le Cancer, Comité du Doubs ; Institut National du Cancer ; Région de Franche-Comté et Ville de Besançon.

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DISCUSSION

M. Gilles CREPIN

Dans les cancers invasifs du col utérin, a-t-on pu mettre en évidence des séquences d’ADN viral dans les ganglions iliaques sains ou métastatiques prélevés lors des lymphadénectomies pelviennes ?

Oui, des séquences d’ADN d’HPV ont pu être mis en évidence dans des ganglions pelviens histologiquement sains chez des patientes présentant un cancer invasif du col utérin. Le nombre d’étude est limité et la signification clinique n’est pas claire, en particulier, il n’est pas prouvé que cela puisse constituer un marqueur prédictif d’une récidive tumorale.


* EA 3181, IFR 133, Université de Franche-Comté, Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, CHU Jean Minjoz, 25030 Besançon. Tirés à part : Docteur Jean-Luc PRÉTET, même adresse. Article reçu le 23 février 2007, accepté le 19 mars 2007.

Bull. Acad. Natle Méd., 2007, 191, no 3, 611-623, séance du 27 mars 2007