Résumé
Dans le cadre d’un programme de mutagenèse induite par ethyl-nitroso-urée (ENU), une mutation faux-sens (p.S140G) a été identifiée dans l’exon 4 du gène Tuba1. La souris mutée présente un comportement hyperactif et une lamination anormale de l’hippocampe, rappelant les anomalies décrites chez les souris inactivées pour les gènes Lis1 et Doublecortine (DCX). Les homologues humains de ces deux gènes sont impliqués dans des pathologies présentant un spectre phénotypique large allant de l’hétérotopie laminaire sous-corticale à la lissencéphalie. Par ailleurs, LIS1 et DCX jouent un rôle dans la régulation des microtubules du cytosquelette ce qui nous a permis de considérer Tuba3, homologue humain de Tuba1, comme un gène candidat impliqué dans des lissencéphalies chez des patients ne présentant pas de mutations des gènes LIS1 et DCX. Ces données nous ont amené à rechercher des mutations dans le gène Tuba3 chez des patients atteints de malformations corticales chez lesquelles aucune mutation dans les gènes LIS1 et DCX n’avait été découverte. Cette hypothèse a été confirmée en identifiant des mutations faux-sens de novo dans le gène Tuba3 chez huit patients présentant des malformations corticales plus ou moins sévères. Par une étude approfondie de l’imagerie et/ou des coupes de cerveaux de ces patients, nous avons mis en évidence, en plus de la malformation corticale, des caractères phénotypiques communs tels que des anomalies du corps calleux, du cervelet, du vermis cérébelleux et de l’hippocampe. Ces travaux nous ont donc permis d’impliquer un nouveau gène dans des cas sporadiques de lissencéphalie et d’énoncer des traits communs qui pourraient orienter la recherche de mutation dans le gène Tuba3 lors du diagnostic clinique.
Summary
A missense mutation, p.S140G in exon 4 of the tubulin alpha-1, was recently identified in a hyperactive ENU induced mouse mutant with abnormal lamination of the hippocampus. Phenotypic similarities between this mutant and mice models deficient for Lis1 and Dcx, as well as the known implication of LIS1 and DCX in human lissencephaly spectrum of phenotypes, and in the regulation of microtubule cytoskeleton dynamics, lead us to consider Tuba3, the human homologue of Tuba1, as a candidate gene for neuronal migration disorders with no mutation in LIS1 and DCX. Here we report the identification of additional Tuba3 missense mutations in eight additional unrelated patients (five living individuals and three fœtuses) with a spectrum of cortical brain dysgeneses extending from laminar heterotopia to severe lissencephaly. The de novo occurrence was shown for all the tested mutations, including one recurrent mutation (Arg264Cys detected in two patients) and two mutations that affect the same amino acid. Remarkably, each of the two patients who are mutated for the same amino acid have an almost identical clinical and/or imaging phenotypes. Interestingly, in addition to cortical abnormalities, most of the patients have in common additional cerebellum, hippocampus, corpus callosum and brainstem abnormalities that would allow to predict and orient towards an implication of Tuba3 gene.
INTRODUCTION
Certaines malformations du système nerveux central (telles que les hétérotopies périventriculaires, les hétérotopies laminaires sous-corticales et la lissencéphalie type I) présentent des cellules corticales hétérotopiques suggérant une anomalie de la migration. Dans les formes les plus sévères, les problèmes de migration neuronale sont associés à une lissencéphalie de type I, caractérisée par une surface lisse du cerveau et des anomalies du cortex, formé de couches de neurones immatures organisées de manière anarchiques. Les formes les moins sévères présentent une pachygyrie, caractérisée par un aspect simplifié des circonvolutions corticales, ou des hétérotopies laminaires sous-corticales (SCLH), souvent décrites comme un double cortex [1, 2]. Ces malformations sont généralement associées à des phénotypes cliniques de gravité variable, allant du retard mental sévère associé à l’épilepsie (souvent pharmaco résistante) à une épilepsie légère associée à des bandes hétérotopiques mineures. Les études génétiques des formes classiques de lissencéphalie type I ont montré l’implication dans différentes syndromes associés à des lissencéphalies de deux gènes localisés sur le chromosome X, Doublecortine (DCX ) et aristaless related homeobox gene ( ARX) ; et de trois gènes autosomiques LIS1 ,
Reelin (RELN) , very low density lipoprotein receptor (VLDLR) [3].
Des souris inactivées (Knock-out, KO) pour
Dcx et Lis1 ont été générées [4-7].
L’absence d’anomalies de développement du néocortex chez les souris mutantes contraste avec la désorganisation majeure du cortex humain. Néanmoins, des anomalies hippocampiques ont été décrites chez les souris adultes Lis1 hétérozygotes [8] et
Dcx hémizygotes [4, 7]. Les anomalies observées chez ces deux modèles
affectent des régions différentes de l’hippocampe. Le modèle
Lis1 montre une couche de cellules pyramidales CA1 désorganisées tandis que le modèle
Dcx pré- sente une désorganisation dans la couche CA3 de l’hippocampe suggérant un rôle différent de ces deux gènes dans le développement de cette structure.
Des anomalies hippocampiques similaires à celles observées chez les souris KO pour Lis1 et Dcx ont été décrites par une équipe d’Oxford chez une souris hyperactive induite par mutagenèse éthyl-nitroso-urée. Ce modèle porte une transition T vers C (p.S140G) dans l’exon 4 du gène de l’alpha1 tubuline ( Tuba1 ). Au niveau fonctionnel cette mutation entraîne une réduction de la fixation du GTP et perturbe la formation native d’hétérodimères [9].
Les similarités neuroanatomiques entre la souris mutante Tuba1 et les souris déficientes pour
Dcx et Lis et l’existence d’une interaction fonctionnelle entre Dcx et les MT ont permis de supposer que le gène de l’ alpha 3 tubuline ( Tuba3 ), gène homologue de
Tuba1 , pourrait être impliqué dans une pathologie de migration neuronale.
Dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe d’Oxford, nous avons étudié l’implication de Tuba3 sur une cohorte de patients atteints de lissencéphalie sans mutations dans les gènes
LIS1 et DCX . Nous avons ainsi identifié huit mutations faux-sens de novo dans le gène Tuba3 chez des patients sporadiques, atteints d’un large spectre de dysgénésie corticale. Des analyses d’IRM et des études neurofœtopathologiques ont permis de définir des combinaisons d’anomalies associés à la pathologie telles qu’un développement anormal du cervelet, des anomalies du corps calleux et du tronc cérébral permettant d’orienter le diagnostic moléculaire et la confirmation de l’implication du gène Tuba3 dans les pathologies caractérisées par des anomalies de la migration neuronale.
RÉSULTATS
IDENTIFICATION DE MUTATIONS de novo DANS LE GENE TUBA3
Le gène
Tuba3 est localisé en position q13.12 du chromosome 12. Il compte 4 exons et possède une seule phase ouverte de lecture de 1677 paires de bases codant pour une protéine de 451 acides aminés. La protéine possède deux domaines fonctionnels : un domaine GTP-ase permettant de lier le GTP (acides aminés 49 à 246) et 1 domaine tubuline C-ter (acides aminés 248 à 393, Figure 1).
Nous avons étudié quatre-vingt seize patients présentant une dysgénésie corticale.
Ils ont été préalablement analysés au laboratoire de diagnostic de l’hôpital Cochin, afin d’effectuer une recherche de mutations pour les gènes DCX et LIS1 qui s’est révélée négative. Une étude a été menée en parallèle sur huit fœtus atteints d’un retard de développement du cerveau et une lissencéphalie ou une dilation ventriculaire suspectée sur la base d’une échographie ou d’une IRM. Notre travail a ainsi
FIG. 1. — Structure de la protéine TUBA3 FIG. 2. — Mutation p.R264C et illustration des données d’imagerie ; (A) Arbres généalogiques des patients (F : Père, M : Mère, P : Patient) ; (B). Electrophorégramme correspondant aux séquences du gène Tuba3 chez les parents et le patient GAR. Le symbole * représente la position de la mutation C en T ; (C) Conservation inter-espèce de la position protéique 264 ; (D) IRM des patients GAR et SCH ; A et D. Coupe sagittale, la flèche du haut montre l’absence de corps calleux, la flèche du bas l’hypoplasie vermienne ; B et E. Coupe coronale de la partie postérieure ; C et F. Coupe coronale la flèche montre les anomalies de circonvolutions corticales.
permis d’identifier des mutations dans le gène Tuba3 chez huit patients atteints de lissencéphalie de type I et d’hétérotopies laminaires résumé dans le Tableau 1. Ces mutations sont toutes localisées dans l’exon 4 du gène.
Afin d’établir que les variations décrites étaient bien la cause de la pathologie, nous avons analysé le gène Tuba3 chez les parents des patients pour lesquels des échantillons d’ADN étaient disponibles. Aucune mutation n’a été détectée chez les
parents ce qui suggère l’apparition de novo de ces mutations. Pour consolider nos résultats, la parenté a été vérifiée par l’étude de ségrégation de onze marqueurs polymorphiques informatifs du chromosome 22.
Nous avons aussi recherché ces mutations chez 360 témoins et aucun ne porte ces mutations.
Parmi les mutations décrites dans ce rapport, la mutation c.790C>T (p.R264C) a été identifié chez deux patients non apparentés (Figure 2A et 2B). Ces deux patients présentent un retard mental modéré à sévère mais ne sont pas épileptiques et ne présentent pas d’électroencéphalogramme (EEG) anormal. Une étude neuropathologique montre que ces patients présentent des anomalies corticales modérées avec une pachygyrie et une dysplasie au niveau du cortex temporal et du sillon de Rolando, accompagnées d’une organisation anormale de l’hippocampe et une hypoplasie du vermis cérébelleux inférieur et du tronc cérébral (Figure 2D).
Chez deux autres patients (Figure 3), les mutations identifiées (c.1205G>A, c.1204C>T) (Figure 3A et 3B) sont localisées dans le même codon et induisent un changement de l’acide aminé arginine en position 402, soit en histidine, soit en cystéine (p.R402H et p.R402C). Dans les deux cas, les IRM (Figure 3D) montrent la présence d’une lissencéphalie sévère avec un cortex épais et désorganisé, accompagnée d’anomalies du corps calleux (agénésie complète chez le fœtus MOT et agénésie du splénium chez le patient LAM), d’une agénésie du vermis inférieur et une hypoplasie du tronc cérébral (Figure 3).
D’autres mutations dans le gène Tuba3 ont également été identifiées chez plusieurs patients sporadiques (Tableau 1) : c.562A>C (p.I188L), c.787C>A (p.P263T), c.856C>T (p.L289F) et c.1256C>T (p.S419L). Le patient LAB portant la mutation p.I188L a présenté précocement des convulsions (un mois) puis une épilepsie sévère.
L’IRM montre la présence d’une hétérotopie laminaire (ou double cortex), une agénésie du corps calleux et une hypoplasie du vermis.
Les données cliniques, neuroanatomiques et d’imagerie concernant les autres mutations : p.S419L, p.L289F et p.P263T respectivement sont résumées dans le tableau 1.
DISCUSSION
Au cours de cette étude, nous avons démontré l’implication du gène
Tuba3 dans un large spectre de désordre de migration neuronale. Ces découvertes ont été possibles grâce à l’identification d’une mutation dans le gène Tuba1 chez une souris présen(tant une hyperactivité qui reflète un trouble du comportement ainsi qu’une lamination anormale de l’hippocampe. Les stratégies de génétique conventionnelle nous auraient difficilement permis d’identifier le gène décrit dans ce rapport. En effet, ces mutations survenant de façon sporadique chez les patients, il est difficile d’envisager
FIG. 3. — Mutations p.R402H et p.R402C et illustration des données d’imagerie ; (A) Arbres généalogiques des familles LAM et MOT (F : Père, M : Mère, P : Patient) (B) Électrophorégramme correspondant aux séquences du gène Tuba3 chez les parents LAM et les patients
LAM et MOT. Le symbole * représente la position de la mutation C en T ; (C) Conservation inter-espèce de la position protéique 402 ; (D) IRM des patients LAM et MOT ; A et D. Coupe sagittale, la flèche du haut montre l’absence de corps calleux, la flèche du bas l’hypoplasie vermienne ; B et E. Coupe axiale, la flèche montre le microcéphale ; C et F. Coupe coronale.
des études de liaison et de localisation génétique. Les mutations dans Tuba3 semblent a priori associées à un spectre phénotypique large (incluant des patients épileptiques et des dysgénésies corticales). Cependant un examen attentif des données histologiques et d’imagerie a permis de mettre en évidence des combinaisons de données neuroanatomiques distinctes de celles habituellement décrites dans des mutations de DCX , LIS1 et d’ ARX . En effet, la combinaison des désorganisations
du cortex à une hypoplasie du cervelet, à une agénésie/hypoplasie du vermis infé- rieur et du corps calleux, à une hypoplasie du tronc cérébral et à une désorganisation hippocampique semble être un phénotype commun résultant des mutation Tuba3 .
Si chacune de ces anomalies peut être retrouvée chez des cas résultant de mutations dans LIS1 , DCX , ARX et RELN , leur combinaison chez un même patient doit nous orienter vers une implication du gène
Tuba3 .
Nos données indiquent que 30 à 40 % des patients (3/10) et des fœtus (3/8) avec l’ensemble des anomalies cérébrales décrites précedemment (cortex, cervelet, corps calleux,…) portent une mutation dans le gène Tuba3 .
Nos études histologiques et immunologiques réalisées en collaboration avec Catherine Fallet-Bianco (hôpital Sainte-Anne, Paris) montrent la présence de cellules neuronales hétérotopiques dans la substance blanche des cerveaux pathologiques, y compris dans les structures du pont et du cortex cérébelleux.
Ces données suggèrent que l’arrêt ou le retard de migration sont des processus physiopathologiques qui contribuent aux anomalies de la lamination et à l’organisation anormale des structures du cerveau. Par ailleurs, le nombre réduit de cellules MAP2 positives présentent dans le cortex et l’absence de fibres callosales indiquent une anomalie de la différenciation et/ou de la croissance axonale des neurones durant les stades précoces du développement.
L’identification de mutations dans le gène Tuba3 chez des patients atteints de malformations corticales tend à renforcer la pertinence de l’existence des interactions fonctionnelles entre DCX et les MT. En plus des retombées médicales dans le domaine du diagnostic et du conseil génétique, ces résultats ouvrent aussi des perspectives pour la compréhension des mécanismes cellulaires impliqués dans la migration neuronale.
REMERCIEMENTS
Nous tenons à exprimer nos remerciements pour les patients et leurs familles ainsi qu’aux médecins et aux équipes médicales qui nous ont fait confiance et nous ont adressé pour exploration moléculaire l’ADN des patients. Nous exprimons notre reconnaissance au Docteurs Catherine Fallet-Bianco pour son aide pour les analyses histologiques.
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* Institut Cochin, INSERM Unité 567, Université René Descartes Paris 5. Équipe de Génétique et Physiopathologie des Retards Mentaux. 24, rue du Faubourg St Jacques — 75014 Paris. Tirés à part : Professeur Jamel CHELLY, même adresse.
Bull. Acad. Natle Méd., 2006, 190, no 9, 1925-1933, séance du 5 décembre 2006