Communication scientifique
Session of 5 avril 2005

Rôle des cellules souches dans la réparation cardiaque

MOTS-CLÉS : cellule souche. insuffisance cardiaque congestive. moelle osseuse.. muscle squelettique
Role of stem cells in cardiac repair
KEY-WORDS : bone marrow.. heart failure, congestive. muscle, skeletal. stem cells

Philippe Menasche

Résumé

L’utilisation des cellules souches pour réparer le cœur est fondée sur la capacité prêtée à ces cellules de se transformer en cardiomyocytes et de restaurer ainsi la fonction d’un myocarde défaillant. En ce qui concerne les cellules souches adultes, l’espoir qu’elles puissent se transdifférencier et acquérir ainsi le phénotype des cellules qu’elles sont supposées remplacer, a généré un enthousiasme que tempère aujourd’hui la reconnaissance des limites de cette plasticité. Ceci est tout particulièrement vrai pour les cellules souches du muscle qui restent complètement fidèles à leur programmation myogénique mais la remarque vaut également pour les cellules de la moelle osseuse dont la transformation en cardiomyocytes est au mieux exceptionnelle et quantitativement infime. Ces limites n’empêchent pas les cellules souches adultes d’exercer des effets bénéfiques sur la fonction, sans doute médiés par d’autres mécanismes, notamment paracrines. Ce problème pourrait théoriquement être réglé par les cellules souches cardiaques récemment découvertes mais la possibilité d’une exploitation thérapeutique de cette population reste encore aujourd’hui très aléatoire. Aussi les espoirs les plus solides se portent-il actuellement vers les cellules souches embryonnaires qui à condition d’être correctement pré-orientées pendant la phase de culture peuvent véritablement se transformer en cardiomyocytes et contribuer de façon efficace à la réparation anatomique et fonctionnelle d’un cœur défaillant.

Summary

The use of stem cells for cardiac repair is based on their potential to become cardiomyocytes and thereby to restore the functional capacity of the failing heart. The concept of transdifferentiation, by which adult stem cells adopt the fate of the cells they are intended to replace, generated enormous enthusiasm, but it is increasingly recognized that the plasticity of these cells is rather limited. This is particularly the case of skeletal myoblasts, which remain committed to their myogenic lineage. Likewise, conversion of bone marrow-derived cells into cardiomyocytes is, at most, an exceptional and quantitatively limited event. These limitations do not preclude the possibility that adult stem cells could have protective effects on left ventricular function, possibly through a paracrine action. Tissue-resident cardiac stem cells were recently identified but significant hurdles will have to be overcome if they are to be used for therapeutic purposes. Consequently, much hope is currently being placed in embryonic stem cells which, provided they are appropriately precommitted during culture, can differentiate into cardiomyocytes. Their subsequent electromechanical integration into the recipient myocardium can contribute to the repair of the damaged heart.

Les cellules souches sont définies par deux caractéristiques principales : — une capacité d’auto-renouvellement pratiquement infinie sous réserve qu’elles soient placées dans un milieu de culture approprié, — la possibilité de donner naissance aux cellules constituant tous les tissus dérivés des trois feuillets embryonnaires primitifs.

Il n’est donc pas surprenant qu’au vue de la prévalence croissante de l’insuffisance cardiaque (120.000 nouveaux cas par an en France) et des limites reconnues des traitements actuels, l’utilisation des cellules souches soit depuis quelques années considérée comme un nouveau moyen thérapeutique possible pour régénérer les myocardes défaillants. Cet objectif toutefois est encore loin d’être atteint et l’analyse des résultats obtenus à ce jour tout comme des perspectives, nécessite d’abord qu’une distinction claire soit faite entre les cellules souches embryonnaires et les cellules souches adultes.

CELLULES SOUCHES ADULTES

Une étape fondamentale dans la biologie des cellules souches a certainement été le clonage de la brebis Dolly en 1996. La possibilité de dériver un animal entier à partir d’un seul noyau d’une cellule somatique, nous a en effet appris que la différenciation terminale des cellules n’était pas un événement irréversible et que ces noyaux adultes pouvaient dans certaines conditions être reprogrammés. Ainsi s’est largement développée la notion que les cellules souches adultes que l’on croyait spécifiques d’un tissu donné avaient sans doute une plasticité plus importante que celle qu’on leur prêtait traditionnellement. Ce concept s’est trouvé conforté par de multiples études suggérant une transdifférenciation de ces cellules souches adultes c’est-à-dire leur capacité à acquérir un nouveau phénotype en réponse à des signaux spécifiques et notamment ceux présents dans un tissu lésé. Nombreuses ont alors été les publications rapportant des transformations telles que sang ⇒ endothélium, sang ⇒ cerveau, cerveau ⇒ sang, sang ⇒ muscle squelettique, muscle squelettique ⇒ sang, sang ⇒ épithélium, sang ⇒ cardiomyocyte.

Après quelques années toutefois, le pendule s’est mis à osciller dans une direction inverse au fur et à mesure que des techniques plus rigoureuses ont été utilisées pour
suivre le devenir des cellules dans un tissu donné. C’est ainsi par exemple que la conversion apparente des cellules musculaires squelettiques en cellules sanguines s’est révélée en réalité être due à la présence inattendue de cellules souches hématopoïétiques dans les tissus solides ; de même a-t-il été montré que la conversion des cellules médullaires en hépatocytes résultait entièrement de la fusion des macrophages avec les cellules hépatiques du receveur suivie d’une reprogrammation du noyau des macrophages et non d’une véritable transdifférenciation. Ces limites s’appliquent également aujourd’hui au système cardio-vasculaire ; encore faut-il distinguer ici trois variétés de cellules souches.

Cellules souches musculaires

Encore appelées cellules satellites ou myoblastes, ces cellules précurseurs qui existent normalement à l’état quiescent sous la membrane des fibres musculaires, sont, en cas d’agression, rapidement mobilisées ; elles prolifèrent alors activement puis fusionnent pour régénérer les fibres endommagées. Ces cellules ont d’emblée généré un grand intérêt en raison de la pertinence clinique de certaines de leurs caractéristiques : une origine autologue, une programmation exclusivement myogénique garantissant l’absence de développement tumoral, un potentiel important d’expansion in vitro et une assez bonne résistance à l’ischémie. Pendant une décennie, de multiples travaux expérimentaux menés tant chez le petit que chez le gros animal ont ainsi montré de façon cohérente que les myoblastes implantés dans une zone d’infarctus se différenciaient en myotubes typiques et permettaient une amélioration de la fonction ventriculaire gauche [1, 2]. L’absence de couplage électromécanique entre les cellules musculaires greffées et les cardiomyocytes du receveur [3] pose d’ailleurs le problème du mécanisme de cette amélioration qui pourrait en fait être liée à une limitation du remodelage ventriculaire voire à des effets paracrines agissant sur la matrice extra-cellulaire. Quoiqu’il en soit, il est tout à fait clair que ces myoblastes ne se transforment jamais en cardiomyocytes (à l’exception de quelques rares fusions à l’interface hôte-greffon [4]) et qu’on ne peut donc pas véritablement parler d’une régénération du tissu myocardique infarci par les cellules transplantées.

Néanmoins, la concordance des bénéfices fonctionnels mise en évidence expérimentalement a conduit dès 2000 à commencer des essais cliniques [5, 6, 7]. La plupart d’entre eux ont comporté des implantations chirurgicales de myoblastes au cours d’interventions de pontage coronaire, plus rares étant les injections de cellules réalisées à titre isolé par cathétérisme percutané [8]. Globalement, ces études de phase 1 ont principalement permis de confirmer la faisabilité de la technique, c’est-à-dire la possibilité d’obtenir à partir de quelques grammes d’une biopsie musculaire plusieurs centaines de millions de cellules, ainsi que la tolérance de cette transplantation, les multiples injections de cellules dans la zone infarcie n’ayant jamais entraîné de complications spécifiques. On notera toutefois que certains patients ont présenté des troubles du rythme ventriculaire post-opératoires précoces dont il est encore difficile de dire s’ils sont directement liés à l’implantation des cellules ou à la maladie sous-jacente dont on sait qu’elle est intrinsèquement
arythmogène. Les quelques données anatomopathologiques disponibles [9,10] ont par ailleurs confirmé les observations expérimentales que le taux de greffe était en réalité très faible en raison de la mort d’un grand nombre de cellules ou de leur fuite dans la circulation systémique. Il apparaît donc que le développement de stratégies permettant d’optimiser la survie cellulaire est un objectif majeur si l’on veut améliorer les résultats fonctionnels de ce type de transplantation.

De par leur conception, aucune de ces études pilotes n’a permis de tirer des conclusions valides en terme d’efficacité. C’est la raison pour laquelle a été maintenant mis en place un essai multi-centrique, randomisé, contrôlé et en double aveugle dont l’objectif spécifique est précisément d’analyser les modifications de la contractilité des segments greffés. Pour des raisons de sécurité, tous les patients inclus dans cet essai sont par ailleurs implantés avec un défibrillateur automatique dont l’un des intérêts est de permettre un enregistrement des événements rythmiques. Ainsi devrait-il être possible de tirer à partir de cette étude des conclusions rigoureuses concernant aussi bien l’efficacité fonctionnelle de la technique que son éventuel risque arythmogène. À ce jour, ce dernier ne semble pas d’ailleurs aussi important que certains l’avaient pensé puisqu’une première analyse aveugle portant sur 44 patients dont les enregistrements sont disponibles montre que seulement deux d’entre eux ont dû être défibrillés pour tachycardie ventriculaire soutenue.

Cellules souches de la moelle

L’espoir que les cellules de la moelle puissent se transdifférencier en cardiomyocytes et le nombre considérable de travaux documentant leur activité angiogénique ont conduit de nombreuses équipes cliniques à passer rapidement du petit animal à l’homme. Cet engouement pour la régénération cardiaque par les cellules médullaires a également été favorisé par la simplicité de la procédure (limitée dans la plupart des cas à une biopsie de crête iliaque suivie de la réinjection quasi-immédiate de moelle non fractionnée) et le caractère assez peu contraignant des contraintes réglementaires. Peut-être a-t-on toutefois occulté le fait que la moelle est un tissu extraordinairement hétérogène qui ne contient que très peu de cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses (environ 0,01 % de la population totale).

Lorsqu’on analyse les essais cliniques ayant porté sur la moelle non fractionnée, il est donc important de conserver à l’esprit que les cellules supposées exercer un effet thérapeutique sont pour plus de 99 % d’entre elles déjà différenciées.

Alors que les études portant sur les myoblastes squelettiques se sont concentrées sur l’insuffisance cardiaque chronique responsable d’une dysfonction ventriculaire gauche sévère, la plupart des essais thérapeutiques sur les cellules médullaires concernent des patients vus au stade aigu de l’infarctus du myocarde. De ce fait, la technique a toujours consisté en une injection intra-coronaire directe des cellules médullaires après que le vaisseau ait été reperfusé par angioplastie habituellement suivie de la mise en place d’une endoprothèse. Globalement, les résultats de ces essais apparaissent positifs avec une amélioration de la perfusion, de la viabilité et de la fonction du territoire injecté [11, 12]. Ces résultats sont toutefois à interpréter avec
prudence en raison de limites méthodologiques majeures (effectif habituellement faible, absence de groupe contrôle et d’évaluation en double aveugle). Dans ce contexte, une récente étude allemande mérite d’être signalée puisqu’elle est la première à avoir comporté une randomisation des patients, même si le groupe contrôle n’a pas reçu d’injection placebo [13]. Ses résultats montrent une amélioration de la fraction d’éjection ventriculaire gauche chez les patients traités mais il semble que ce bénéfice ait tendance à s’estomper dans le temps en raison d’une amélioration progressive et spontanée dans le groupe contrôle. D’autres essais randomisés sont actuellement en cours et il n’est pas douteux que leurs résultats devraient contribuer à clarifier le débat. Plus rares ont été les essais de thérapie cellulaire utilisant la moelle chez des patients présentant soit une ischémie réfractaire [14] soit une insuffisance cardiaque chronique [15, 16]. Les résultats à ce jour ne sont que moyennement convaincants.

Trois observations principales peuvent être faites à partir des résultats publiés :

— la technique elle-même paraît sûre et dénuée d’effets secondaires, du moins immédiats ; il sera en effet important de s’assurer que l’augmentation présumée de l’angiogenèse induite par les cellules de moelle n’a pas comme effet pervers une accélération parallèle de l’athérogenèse ;

— le choix du type cellulaire idéal reste à clarifier. Ainsi qu’on l’a dit, la moelle non fractionnée a été utilisée dans la plupart des essais mais il n’est pas impossible que des populations sélectionnées de progéniteurs hématopoïétiques ou de cellules souches mésenchymateuses ne soient pas fonctionnellement plus efficaces ;

— enfin une grande incertitude persiste quant aux doses à utiliser et il est assez surprenant de constater que des effets thérapeutiques quasiment identiques ont été obtenus alors qu’existent d’une série à l’autre des écarts considérables dans le nombre de cellules administrées (de 9 × 106 à 2 × 109 ).

À la lumière des connaissances actuelles, il est permis de conclure que les cellules de moelle ne permettent pas une véritable régénération cardiaque dans la mesure où leur transformation en cardiomyocytes à supposer qu’elle se fasse ne concerne qu’un nombre infinitésimal d’entre elles [17]. Leurs effets bénéfiques procèdent donc plus vraisemblablement d’une augmentation de l’angiogenèse, ce qui est cohérent d’ailleurs avec le fait que la cellule souche hématopoïétique et la cellule endothéliale ont un ancêtre commun, l’hémangioblaste. Il a en effet été bien montré que les cellules de moelle étaient capables de libérer des quantités importantes de cytokines et de facteurs de croissance angiogénique [18]. On conçoit d’ailleurs que ces effets paracrines soient plus efficaces au stade aigu de l’infarctus du myocarde, quand persistent encore des plages de tissu réversiblement lésées, qu’au stade plus tardif de l’insuffisance cardiaque chronique où la cicatrice fibreuse séquellaire n’a guère de chance d’abriter encore les signaux requis pour une éventuelle différenciation des cellules de moelle.

Cellules souches cardiaques

De découverte récente, elles ont été identifiées par plusieurs équipes, sur la base d’ailleurs de marqueurs différents, ce qui ne simplifie pas leur caractérisation phénotypique [19, 20]. La découverte de ces cellules est conceptuellement importante puisqu’elle remet en cause le dogme du caractère terminalement différencié des cardiomyocytes et suggère que, tout comme d’autres organes, le cœur dispose d’un système d’auto-réparation. L’utilisation thérapeutique éventuelle de ces cellules est naturellement séduisante, l’idée étant de pratiquer une biopsie endomyocardique, d’isoler ces cellules souches dans le fragment de tissu ainsi retiré puis de les expandre in vitro avant de les réinjecter. De nombreux problèmes restent toutefois à résoudre, notamment la confirmation que cette population de cellules souches persiste à l’âge adulte et tout particulièrement chez l’insuffisant cardiaque, la possibilité de localiser les niches qui les abritent afin de guider les prélèvements, le choix des marqueurs permettant de les identifier et le maintien de leur pouvoir de différenciation cardiomyogénique pendant la phase d’expansion in vitro .

Au total, les travaux actuellement menés sur ces cellules souches cardiaques permettront certainement de faire avancer les connaissances dans le domaine de la biologie du développement mais il n’est pas encore certain qu’on puisse dépasser ce cadre cognitif pour rejoindre celui de la thérapeutique active.

CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES

Avec les cellules souches cardiaques, les cellule souches embryonnaires sont sans doute les seules qui peuvent véritablement réparer un cœur défaillant. Correctement pré-orientées vers un phénotype cardiaque, ces cellules peuvent en effet se transformer en véritables cardiomyocytes et recoloniser un tissu infarci. La possibilité de les amplifier à grande échelle in vitro ajoute encore à leur intérêt thérapeutique éventuel. Expérimentalement, il a déjà été bien établi que la transplantation de cellules souches embryonnaires murines dans des modèles d’infarctus du myocarde chez le rat était associée à une différenciation des cellules greffées en cardiomyocytes et à une amélioration de la fonction ventriculaire gauche, sans formation de tératome ni rejet malgré l’absence d’immunosuppression [21, 22]. Plus récemment, nous avons pu confirmer ces résultats en implantant des cellules murines dans des cœurs infarcis de mouton. La démonstration la plus claire de l’intégration électro-mécanique de ces cellules dans le myocarde receveur est apportée par une étude récente montrant chez des porcs dont le système de conduction auriculo-ventriculaire naturel a été détruit, qu’il est possible de rétablir une activité cardiaque électrique à partir d’un foyer de cellules souches embryonnaires humaines implantées dans le ventricule gauche [23]. Certes, mis à part les aspects éthiques, des questions importantes restent en suspens qui portent notamment sur le pouvoir immunogène et oncogénique de ces cellules. La recherche très active en ce domaine devrait pouvoir apporter des réponses à ces interrogations dans un avenir relativement proche et il faut de ce point
de vue se féliciter des dispositions récentes qui légalisent l’importation des cellules souches embryonnaires humaines en France et permettront à nos équipes de joindre leurs efforts à ceux de la communauté scientifique internationale. Ainsi ces travaux permettront-ils peut-être enfin, de savoir si le vieux rêve de la régénération tissulaire et notamment myocardique peut enfin devenir une réalité thérapeutique.

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DISCUSSION

M. Yves GROSGOGEAT

Dans la cellule squelettique, que deviennent les organites : mitochondries, réticulum sarcoplasmique, protéines contractiles ? Dans la contraction cardiaque, les connections cellulaires son essentielles : existe-t-il des disques intercalaires, des desmosomes, des gap-jonctions, etc. ? Des cellules squelettiques ou les cellules souches sont-elles capables d’initier une néo-vascularisation ?

Les myoblastes transplantés conservent un phénotype de type purement squelettique et n’expriment donc aucun marqueur cardiaque, et en particulier aucune des protéines constitutives des jonctions communiquantes (du moins in vivo car ces protéines peuvent être exprimées en culture). La capacité des cellules greffées à initier une vascularisation est discutée ; nous ne l’avons pas observée avec les myoblastes ; en revanche, les cellules de la moelle sont vraisemblablement capables d’induire une néo-angiogenèse, principalement par le biais de la secrétion de facteurs de croissance angiogénique (plus que par leur incorporation dans les néo-vaisseaux sous forme de cellules endothéliales).

M. Michel BOUREL

Qu’en est-il du facteur angiogénétique ? Quel est le mécanisme des fibrillations après greffes cellulaires ? L’immunotolérance en cas de xénogreffe est-elle liée au temps de culture in vitro préalable ?

La question concernant l’angiogenèse rejoint celle de Monsieur Grosgogeat et je viens donc d’y répondre. En ce qui concerne les tachycardies (plus que les fibrillations) ventriculaires qui ont été observées, il convient d’abord de rappeler que rien ne permet encore d’affirmer une causalité directe entre leur survenue et la greffe des myoblastes tant la maladie causale qu’est l’insuffisance cardiaque prédispose par elle-même à ces arythmies. Cela étant, il y a au moins deux mécanismes possibles pour les expliquer : soit l’absence de couplage entre cellules greffées et cardiomyocytes du receveur qui peut être à l’origine de micro-réentrées ; soit la génération de courants calciques hétérogènes par les cellules chimériques résultant de la fusion des myoblastes avec les cellules de l’hôte à l’interface greffon/receveur. Seule cependant l’analyse des tracés des défibrillateurs mis en place chez tous les patients de l’essai randomisé en cours permettra une évaluation objective de la prévalence de ces arythmies ventriculaires dans le groupe transplanté.

Enfin, il ne semble pas que l’immunotolérance des cellules souches embryonnaires dans un modèle de xénogreffe soit liée au temps de culture préalable.

M. André VACHERON

L’étude multicentrique MAGIC pilotée par vous-même et par l’équipe de Boston est-elle bien randomisée contre placebo et les malades sont-ils pontés systématiquement ? L’un des écueils des xénogreffes est le transfert potentiel des rétrovirus au receveur. Ce danger existe-t-il avec les cellules souches embryonnaires murines ?

L’essai en question (MAGIC) est en effet randomisé et contrôlé contre placebo. Tous les patients sont soumis à un pontage mais la randomisation devrait permettre de s’affranchir de ce facteur confondant et de dissocier les effets de la revascularisation de ceux de la greffe de myoblastes. En ce qui concerne le risque de transmission de rétrovirus par les cellules souches embryonnaires murines, il est réel et nous travaillons actuellement à le documenter.

M. Luc MONTAGNIER

Ma question concerne le potentiel oncogène à long terme des cellules souches, dans une situation ectopique. On sait que les cancers sont souvent liés à la transformation de cellules souches — ou progénitrices — de l’organe concerné.

Ce risque est réel mais semble surtout concerner les cellules souches complètement indifférenciées. C’est la raison pour laquelle nous programmons les nôtres vers un phénotype précis.

M. Jacques-Louis BINET

Le chapitre des cellules médullaires pour la régénération des cellules cardiaques est-il définitivement fermé ? A-t-on essayé les cellules du cordon ? Définitivement ?

Le chapitre des cellules médullaires n’est pas clos, surtout dans le contexte de l’infarctus du myocarde vu au stade aigu mais l’enthousiasme initial n’est, semble-t-il, plus de mise à la lumière notamment des résultats expérimentaux documentant l’absence (ou le
minime pourcentage) de transdifférenciation de ces cellules en cardiomyocytes ainsi que des résultats de la seule étude randomisée et contrôlée récemment rapportée et qui ne montre aucun gain en termes de fonction ventriculaire gauche globale après injection intra-coronaire de ces cellules médullaires (contrairement aux essais non contrôlés précédents).

Les cellules de sang de cordon ont été essayées mais leur transformation en cellules cardiaques nécessite leur co-culture avec des cardiomyocytes néo-nataux, ce qui en limite singulièrement la pertinence clinique.

M. Georges DAVID

Avez-vous tenté d’utiliser des cellules embryonnaires en voie de différenciation provenant de l’aire cardiogénique qui comporte à la fois des îlots vasculaires et du mésenchyme destinés à donner les tubes cardiaques primitifs ? L’étonnante tolérance xénogénique à l’égard des cellules souches embryonnaires a-t-elle été prouvée dans d’autres conditions expérimentales ?

Nous n’avons pas utilisé des cellules provenant de l’aire cardiogénique mais des cellules du blastocyste qui ont été engagées dans une voie de différenciation cardiogènique par exposition à la BMP 2. Le caractère « immunoprivilégié » des cellules souches embryonnaires murines a été déjà documenté chez le petit animal (cellules de souris injectées à des rats) mais notre étude chez le mouton est la première à la rapporter dans un modèle de gros animal.


* Service de Chirurgie Cardio-Vasculaire de l’Hôpital Européen Georges Pompidou — INSERM U633 — Faculté de Médecine Paris V, Paris, France. Tirés-à-part : Professeur Philippe MENASCHE, même adresse. Article reçu et accepté le 21 mars 2005.

Bull. Acad. Natle Méd., 2005, 189, no 4, 615-624, séance du 5 avril 2005