INTRODUCTION

Les formes actives de l’oxygène (ou radicaux libres oxygénés, RLO) sont des sous-produits du métabolisme oxydatif. Les effets délétères de ces composés dans les étapes du processus de reproduction, spermatogenèse, ovogenèse et embryogenèse sont connus depuis de nombreuses années.

Les RLO les plus importants sont l’anion superoxyde (O -°) le peroxyde d’hydrogène 2 (H O ) et le radical hydroxyl (OH°). Nous limiterons notre étude à ces composés, 2 2 sans envisager le radical oxyde nitrique (NO) qui est produit par l’ovocyte et l’embryon et semble impliqué dans la régulation du développement embryonnaire et la nidation.

Nous définirons les principales origines endogènes et exogènes des RLO et leurs effets sur les gamètes et l’embryon. Les mécanismes défensifs contre le stress oxydatif seront abordés ainsi que les mécanismes de réparation des lésions oxydatives du matériel nucléaire.

ORIGINES ET CIBLES DES FORMES ACTIVES DE L’OXYGÈNE (RLO)

Les RLO ont une origine endogène et exogène. Sous-produits du métabolisme oxydatif, leur formation peut être exacerbée dans certaines conditions. La manipulation in vitro est toujours plus génératrice de RLO (figure 1).

Les spermatozoïdes humains, comme ceux d’autres espèces animales, incubés en aérobiose génèrent spontanément des composés oxygénés réactifs, principalement l’anion superoxyde et le peroxyde d’hydrogène. Ils possèdent une oxydase membranaire qui catalyse la production d’anion superoxyde à partir de l’oxygène en utilisant la NADPH (produit par la voie des pentoses) comme donneur d’électrons. L’anion superoxyde conduit ensuite à la formation du peroxyde d’hydrogène puis du radical

FIG. 1. — Représentation schématique des principales origines des radicaux libres oxygénés dans l’ovocyte et l’embryon hydroxyl (OH°), extrêmement réactif, via les réactions de Haber-Weiss (catalysée par les ions Fe2+) ou de Fenton catalysée par les ions Fe2+ ou Cu+ :

Réaction de Haber-Weiss O -° + H O ——->OH° + OH- + O 2 2 2 2 Réaction de Fenton H O Fe2+(ou Cu+) ——> OH° + OH- + Fe3+ 2 2 + Ainsi, le sulfate ferreux ajouté à la concentration de 25 nanoMolaire dans le milieu de culture induit le doublement de la production des peroxydes lipidiques par le spermatozoïde humain [1], riche en acides gras polyinsaturés.

Le métabolisme du glucose via la synthèse de purines puis d’hypoxanthine et de xanthine peut conduire à la production de RLO par des oxydases (xanthine oxydase : figure 2). L’amine oxydase (EC 1.4.3.6) catalyse la dégradation de spermine et de spermidine en H O et aminoaldéhydes. Le sérum, qui est parfois ajouté aux 2 2 milieux (en production animale) peut en contenir de grandes quantités. De plus cette enzyme est libérée par les spermatozoïdes morts : ceci justifie de raccourcir la durée du contact entre les gamètes lors des fécondations in vitro . Le métabolisme oxydatif, générateur de RLO, est également particulièrement important dans l’embryon

FIG. 2. — Interactions glucose-RLO. Le glucose inhibe l’activité HPRT dans l’embryon (1), favorisant ainsi la production d’hypoxanthine et d’anion superoxyde.

surtout au moment de l’activation génomique [2] et au stade blastocyste : le blastocyste de vache consomme 2 nl d’O par heure soit 5 à 10 fois son propre 2 volume.

Plusieurs facteurs exogènes concourent à augmenter la production de RLO in vitro :

* Les traces d’ions métalliques : des traces d’ions métalliques peuvent aisément contaminer les constituants des milieux de culture et/ou l’eau qui sert à les préparer et initier les oxydations cellulaires via les réactions de Fenton et HaberWeiss De plus, les chélateurs d’ions métalliques tels que l’EDTA (éthylène diamine tétra-acétique acide) ou la transferrine permettent d’éviter le blocage embryonnaire in vitro .

* La lumière : L’augmentation de production de RLO par les embryons in vitro s’expliquerait par les expositions à la lumière visible qu’ils subissent [3]. Ainsi, une exposition de l’ordre de 5 minutes s’accompagne d’une augmentation importante de H O dans l’embryon de souris.

2 2 * L’oxygène : l’effet néfaste pour l’embryon de souris d’une brève exposition à l’oxygène atmosphérique est depuis longtemps établi [4]. Aussi, les embryons
cultivés sous 5 % d’oxygène se développent plus facilement que ceux qui sont exposés à 95 % d’air, soit environ 18 % d’oxygène.

* La présence de polynucléaires neutrophiles au contact des gamètes ou des embryons : elle s’avère extrêmement délétère pour ces cellules via un stress oxydatif. Ceci confirme l’effet néfaste des processus inflammatoires des voies génitales tant mâles que femelles.

Les cibles des RLO sont essentiellement les lipides et les acides nucléiques. Ils induisent des réactions de peroxydation dont les cibles préférentielles sont les acides gras insaturés des phospholipides membranaires. Ils peuvent extraire un atome d’hydrogène de groupements méthylène d’acides gras poly insaturés. Par des réactions en chaîne, radicaux peroxyl (ROO°), hydroperoxydes lipidiques, radicaux alkoxyl (RO°), les peroxydations lipidiques se propagent et s’amplifient. Ces peroxydes déforment les structures membranaires : les lipides passent d’une forme linéaire à une forme tridimensionnelle erratique, qui aura de plus des effets délétères au moment d’une congélation éventuelle.

Les lésions oxydatives affectent également l’ADN du spermatozoïde humain [5].

Des dérivés oxydés des nucléotides sont observés : la 8-hydroxydéoxyguanosine (8-OH-dG ou 8 oxo guanosine) et la thymidine diol. Une corrélation positive a été observée entre l’index de fragmentation de l’ADN spermatique (Sperm Chromatin Structure Assay, SCSA : [6]) et le ratio 8-OH-dG/dG [7]. Même si l’apoptose, physiologique et naturelle au cours de la spermatogenèse, induit également des fragmentations de l’ADN spermatique, le stress oxydatif semble à ce niveau plus important que l’apoptose [5].

CONSÉQUENCES DU STRESS OXYDATIF

Effets bénéfiques des formes actives de l’oxygène

Aussi paradoxal que cela puisse paraître, un certain niveau de RLO est indispensable à la capacitation, à la réaction acrosomique et à la fécondation [8].

Effets néfastes des formes actives de l’oxygène

La peroxydation lipidique dans le spermatozoïde conduit à la perte de phospholipides membranaires, à des pertes de fluidité de la membrane plasmique, de mobilité et au vieillissement des spermatozoïdes. Elle peut interférer négativement avec le processus de fécondation en interdisant les fusions membranaires. La fragmentation de l’ADN (et de l’ARN) peut provoquer une mortalité embryonnaire parfois tardive, liée aux effets mutagènes des lésions oxydatives de l’ADN. La fragmentation de l’ADN des gamètes s’accompagne d’une baisse de leur aptitude à engendrer une descendance. Ceci a été particulièrement démontré pour le spermatozoïde [6]. Par ailleurs, les paramètres classiques du spermogramme (mobilité, tératospermie…) ne
permettent pas d’apprécier l’intégrité de la chromatine. Seule la concentration en spermatozoïdes semble corrélée négativement à la fragmentation qui peut être accélérée par des traitements du sperme in vitro défectueux [9]. Aussi, les patients inféconds traités par ICSI présentent-ils un risque significativement plus élevé de mortalité embryonnaire du fait d’une fragmentation de la chromatine spermatique [10].

Les fragmentations de l’ADN spermatique induites par irradiation n’altèrent pas les taux de fécondation mais s’accompagnent d’une diminution significative des taux d’obtention de blastocystes et de leur capacité à s’implanter [11]. La 8-OH-dG est hautement mutagène, produisant, au delà d’un certain seuil, le remplacement de G-C par T-A lors de la réparation de l’ADN et sa réplication par la DNA polymé- rase [12]. Une élévation des taux en anion superoxyde et en peroxyde d’hydrogène provoque des arrêts de développement embryonnaire in vitro . De plus H O est un 2 2 médiateur de l’apoptose dans le blastocyste.

Enfin, la théorie liant la formation des radicaux libres à l’avancement de l’age « free radical theory of ageing » semble se vérifier au niveau de la qualité ovocytaire. Les antioxydants peuvent permettre de restaurer une certaine qualité ovocytaire chez la femelle âgée [13].

MÉCANISMES DE PROTECTION CONTRE LES RLO IN VIVO

Des mécanismes enzymatiques et non enzymatiques protègent les gamètes et l’embryon contre le stress oxydatif. Ces mécanismes sont présents à la fois dans les cellules et dans leur environnement. Ils sont souvent complémentaires et redondants, ce qui souligne l’importance de cette protection. (Figure 3) Mécanismes non enzymatiques

Dans le plasma séminal : le liquide séminal protège les spermatozoïdes contre les RLO, Il contient des polyamines qui inhibent la peroxydation des lipides et stabilisent la membrane plasmique. Par ailleurs, il est riche d’une part en ions zinc qui est un stabilisateur membranaire, et en transferrine et lactoferrine qui lient les ions ferriques. Le niveau des lésions oxydatives de l’ADN du spermatozoïde est inversement proportionnel au taux d’acide ascorbique du plasma séminal qui semble donc jouer un rôle majeur.

Dans les voies génitales femelles : le spermatozoïde lors de sa remontée, l’ovocyte et l’embryon sont protégés par divers composés présents dans leur environnement (liquides folliculaire et tubaire) : la vitamine C, le glutathion (stocké dans l’ovocyte et qui jouera un rôle dans la décondensation de la chromatine spermatique), l’albumine, le pyruvate, le lactate etc. L’acide lactique et l’acide pyruvique, pré- sents dans les sécrétions tubaires ont également un pouvoir régulateur du potentiel redox. Les gamètes et l’embryon possèdent des transporteurs pour ces composés

FIG. 3. — Représentation schématique de quelques mécanismes de protection de l’embryon in vivo contre le stress oxydatif.

(monocarboxylate transporter ; MCT) [14]. Le pyruvate protège l’embryon contre les RLO, notamment H O . Secrété par l’épithélium du tractus génital femelle, il 2 2 agirait comme antioxydant extracellulaire ou intracellulaire et protègerait l’embryon in vitro ou in vivo contre les lésions de peroxydation induites par H O .

2 2 L’hypotaurine et la taurine (figure 4), présentes dans les liquides tubaire, folliculaire et séminal sont protecteurs du spermatozoïde et de l’embryon. L’hypotaurine neutralise le radical hydroxyl en générant la taurine qui neutralise les aldéhydes cytotoxiques produits lors des peroxydations. L’hypotaurine et la taurine favorisent la fécondation in vitro et le développement embryonnaire chez diverses espèces, y compris humaine. D’une façon plus générale, les aminoacides soufrés, y compris la méthionine, jouent un rôle considérable dans la prévention de l’apoptose, qu’elle soit liée ou non à un déséquilibre redox. Le glutathion qui peut être synthétisé mais pas incorporé par l’embryon est particulièrement efficace. Il agit comme antioxydant direct mais aussi en tant que substrat de la glutathion peroxydase (GPX).

La faible pression partielle en oxygène du liquide tubaire concourt à limiter le stress oxydatif des spermatozoïdes lors de leur remontée dans les voies femelles, de l’ovocyte au moment de la fécondation et de l’embryon lors de sa descente. Ainsi les embryons de vache et de brebis se développent de manière optimale sous une tension

FIG. 4. — Synthèse de l’hypotaurine et de la taurine (

La méthionine peut former de la cystéine par transsulfuration, voie active dans l’embryon).

faible en oxygène : 40 à 60 mm de mercure qui correspond à la pression partielle de l’oxygène dans le liquide tubaire chez la lapine et le singe. Les cellules épithéliales tubaires bovines en culture ont la propriété de diminuer la concentration en oxygène du milieu de culture TCM 199 : l’effet bénéfique de ces cellules sur les embryons co-cultivés est au moins en partie dû à cette propriété.

Mécanismes enzymatiques

Là encore, ils peuvent être endogènes ou présents dans l’environnement. Dans l’utérus et l’oviducte, d’autres mécanismes antioxydants prennent le relais pour protéger le spermatozoïde mais aussi l’ovocyte et l’embryon : la superoxyde dismu-
tase (SOD) la catalase, le système glutathion peroxydase/glutathion réductase (GPX/GR). La SOD transforme les superoxydes en peroxyde d’hydrogène moins toxique, et qui est éliminé soit par le système GPX/GR soit par la catalase.

La catalase semble être la principale enzyme protectrice du spermatozoïde chez l’homme, le taureau et le lapin. Chez la souris la protection du spermatozoïde semble reposer en priorité sur le système GPX/GR. Cependant dans le spermatozoïde l’efficacité de ces défenses est limitée du fait de la pauvreté de son cytoplasme en enzymes protectrices et du faible volume du cytoplasme dans cette cellule. Ceci alors que la richesse de ses membranes en acides gras polyinsaturés le rend très sensible aux RLO. C’est sans doute pourquoi des mécanismes complémentaires de protection sont présents dans l’environnement du spermatozoïde.

La protection de l’ovocyte et de l’embryon contre les RLO repose apparemment sur les 3 mêmes enzymes qui sont présentes dans l’ovocyte et dans l’embryon : protection interne, dans le liquide folliculaire et dans les cellules épithéliales tubaires :

protection externe [15, 16]. Les mécanismes de défense doivent agir très rapidement et ils doivent être présents sur les sites de production des RLO. Ce qui explique leur multiplicité, leur complémentarité et leur caractère redondant. Ainsi la SOD est présente sous 2 formes dans l’ovocyte et l’embryon : Mn-SOD (mitochondriale) et Cu Zn-SOD (cytosolique). Les RLO, produits dans les mitochondries, sites de la phosphorylation oxydative, qui ont échappé à la première sont pris en charge par la seconde. Les transcrits qui codent pour ces enzymes sont stockés dans l’ovocyte au cours des dernières étapes de sa maturation : il est aujourd’hui admis que l’aptitude au développement de l’embryon est en partie liée, qualitativement et quantitativement, à ces facteurs qui ont été stockés par l’ovocyte au cours de sa maturation (notamment les transcrits qui codent pour les principales enzymes antioxydants, SOD, catalase, et GPX). L’activation génomique entraînera immédiatement la synthèse des ARN messagers codant pour ces enzymes antioxydants.

Réparation des lésions oxydatives de l’ADN

Des mécanismes enzymatiques de réparation des lésions oxydatives de l’ADN sont présents dans les cellules des mammifères [12, 17]. Les dégâts induits peuvent être réparés dans l’ovocyte et l’embryon [18, 19]. Dans l’ovocyte, la polymérase bêta [20] et l’endonucléase APEX [21] ont été décrits. Ces mécanismes protègent, bien sûr, le génome. Les protéines Ogg1 constituent le principal système de réparation des lésions oxydatives mutagènes. Chez l’homme le gène OGG1 code pour une DNA glycosylase qui élimine les produits d’oxydation (la 8-OH-dG) de l’ADN [22]. Ces mécanismes sont très probablement présents dans l’embryon puisque les lésions oxydatives et la fragmentation de l’ADN du spermatozoïde ne pénalisent très sévèrement la production d’embryons viables que lorsqu’elles concernent plus de 30 % de la chromatine ou des cellules.

IN VITRO

Éviter le stress oxydatif au cours de la culture des ovocytes et des embryons est un problème complexe. In vitro , la production de RLO est particulièrement importante.

La manipulation des gamètes et des embryons interfèrent avec les mécanismes de défense contre les RLO (généralement par une stimulation de la protection). Ainsi l’addition des antioxydants doit être utilisée avec circonspection. En effet d’une part, par définition, tout antioxydant peut avoir une action pro-oxydante. D’autre part, la production de radicaux libres peut être une étape transitoire nécessaire. Une capacité trop réductrice peut amener des effets collatéraux indésirables : ainsi les composés thiol doivent être utilisés à faibles concentrations car ils tendent à réduire les ponts disulfures avec risque de dénaturation des protéines. Considérant qu’on ne dispose aujourd’hui d’aucune méthode simple pour évaluer le potentiel redox d’un milieu, on perçoit la difficulté de maintenir en permanence le fragile équilibre entre les facteurs pro-oxydants et les facteurs antioxydants. Aussi faut-il essayer de respecter un potentiel redox légèrement réducteur dans les milieux de culture, afin de perturber le moins possible l’équilibre redox des cellules. Pour ce faire, la manipulation du rapport lactate/pyruvate pourra être utilisée. Des composés tels que l’hypotaurine, qui présente le triple avantage de ne pas être un réducteur puissant, de neutraliser le radical hydroxyl et de générer, au cours de cette neutralisation, la taurine qui neutralise les aldéhydes cytotoxiques issus des réactions d’autooxydation, devront être privilégiés.

CONCLUSION

Les radicaux libres constituent un problème sérieux dans les premières étapes du processus de reproduction. Les RLO sont produits physiologiquement de façon continue aussi bien dans les gamètes et l’embryon. Même si la présence de mécanismes de réparation des lésions oxydatives est une réalité, les RLO doivent être neutralisés en permanence.

In vivo , les systèmes de protection sont multiples et redondants, mais leur efficacité décroît avec l’âge. Aussi, des antioxydants peuvent alors être administrés par voie orale. Ils sont utilisés dans les centres de procréation médicale assistée, chez l’homme, lorsque le taux de fragmentation de l’ADN spermatique est supérieur à un certain seuil. Ils peuvent être également donnés aux patientes pour combattre les effets de l’âge.

In vitro, la production de RLO est exacerbée du fait de l’exposition à l’oxygène atmosphérique, à l’éclairement, à la présence de composés pro-oxydants dans les milieux de culture etc. La prévention de leur production ou leur neutralisation n’est pas simple : une « hyper protection » peut se révéler également très délétère.

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DISCUSSION

M. Georges DAVID

Quel est le mécanisme de l’action des radicaux libres sur les lipides membranaires et quelles en sont les conséquences ? Avant l’activation génomique l’embryon vit sur le stock enzymatique antioxydant de l’ovocyte mais est-ce que sa propre synthèse commence rapidement dès le début de l’activation ? Vous avez insisté sur les lésions de l’ADN par les ROS. Quelles peuvent être les conséquences post-natales ?

Les radicaux libres oxygénés forment des peroxydes au niveau des doubles liaisons des acides gras constituant en partie la couche lipidique. Il y a alors formation de molécules de type « pseudoprostaglandines » avec déformation de la structure linéaire de l’acide gras. La molécule « se retourne » à 180 degrés. Il s’ensuit des anomalies de transport de métabolites à transport passif ou actif, dans le cas où il y a déplacement et/ou dénaturation des transporteurs. La division cellulaire est également perturbée avec des ralentissements des cycles cellulaires. Enfin, les gamètes/embryons congelés sont plus fragiles : la couche lipidique qui assure une certaine fluidité ne joue plus son rôle ; a contrario, ces zones peroxydées forment des zones rigides très sensibles à la congélation : elles constituent les points faibles de la membrane. La mise en place des systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion synthétase, glutathion peroxydase) protecteurs contre les formes actives de l’oxygène est simultanée à l’activation génomique. Les dégats des ROS sur l’ADN ont des répercussions délétères plus ou moins tardives ; lors de la grossesse ils peuvent provoquer des avortements jusqu’à cinq mois de gestation. Enfin, il est dorénavant établi que le tabac, induit chez les gros fumeurs, des dégâts qui auront un impact délétère chez leurs descendants. L’augmentation des cancers chez l’enfant étant une des conséquences les mieux documentées.

M. Pierre JOUANNET

Les dérivés actifs de l’oxygène (DAO) peuvent avoir des effets délétères sur les gamètes, mais ils peuvent aussi avoir des effets bénéfiques, lesquels et selon quels mécanismes ? Le contrôle des phénomènes de peroxydation lipidique semble particulièrement important pour le développement de l’embryon pré-implantatoire in vitro. Connaît-on la composition des milieux de culture utilisés en clinique pour la fécondation et le développement in vitro des embryons humains ? Comment sont évalués les effets pro-oxydant ou anti-oxydant de ces milieux ?

Comme dans tous les systèmes biologiques, les équilibres doivent être respectés. Les formes actives de l’oxygène permettent la capacitation du spermatozoïde, étape cruciale précédent immédiatement la pénétration des spermatozoïdes puis la fécondation. Il est également évident que des milieux de culture trop fortement réducteurs pourront altérer la structure secondaire et tertiaire des protéines, ce qui aura un impact sur leur activité.

Le meilleur exemple étant une possible ouverture des ponts disulfure. Il est difficile d’évaluer les effets globaux pro-oxydants et antioxidants. Ils peuvent notamment varier en fonction du pH et de la température. La seule mesure possible est celle, trop imprécise, du pouvoir réducteur. La composition globale des milieux de culture embryonnaire est généralement connue. Certains composés peuvent être « protégés », les concentrations de certains autres peuvent être tenues secrètes.

M. Roger NORDMANN

Dans l’excellent exposé de l’orateur, il a, à juste titre, insisté sur le fait que les dérivés réactifs de l’oxygène ont un rôle indispensable dans la régulation cellulaire et n’ont un rôle délétère que lorsque l’équilibre pro-antioxydant est perturbé. Pour rétablir cet équilibre, n’a-t-il pas expérimenté l’action de chélateurs du fer « libre » (diminuant la production de radicaux agressifs) ou, à l’inverse, d’autres anti-oxydants en dehors de l’hypotaurine (méthionine, esters du glutathion, par exemple). D’autre part a-t-il tenté d’objectiver les altérations membranaires liées au stress oxydatif au niveau des gamètes (par exemple par mesure de la fluidité membranaire ou de la composition en acides gras polyinsaturés ?)

Il faut toujours se rappeler que les études sur l’embryon sont toujours ardues, du fait de la faible quantité de matériel disponible. Par ailleurs, les modèles animaux ne sont pas, de très bons modèles pour l’embryon humain. Il existe bien sûr des analogies mais sans plus.

C’est pourquoi les études sont assez rares pour l’embryon humain, bien que leur insert serait majeur pour éviter la réaction de Fenton. L’EDTA est utilisé à des concentrations de quelques micromoles par litre.

M. Raymond ARDAILLOU

Les formes actives de l’oxygène activent des facteurs de transcription comme NFkB qui entraînent une synthèse accrue de produits pro-inflammatoires. Ce phénomène intervient-il dans la procréation médicale assistée ?

Il intervient au moment de l’implantation. Il n’existe pas d’informations concernant l’embryogenèse précoce.

M. Pierre DELAVEAU

Peut-on incriminer les espèces oxydantes dans le phénomène de diminution du nombre des spermatozoïdes par unité de volume du sperme ?

Ceci est plus que probable. La pollution a un impact majeur sur la fragmentation de l’ADN spermatique. Mais l’on admet actuellement que c’est plus l’utilisation larga manu de composés « Estrogen like » qui a un impact négatif. Ces composés sont utilisés dans certains types de pesticides notamment les herbicides.

M. Roger BOULU

Dans vos conditions expérimentales, observe-t-on « un emballement » de la réparation de l’ADN menant à une hypoxie générative d’apoptose ? Les inhibiteurs d’enzymes de réparation de l’ADN ont-ils été étudiés ?

Il est sûr que s’il est un endroit et un moment où la réparation de l’ADN a un intérêt capital, c’est bien dans le jeune embryon au moment et immédiatement après la fécondation, pour réparer les dégâts éventuels des gamètes et « partir » sur des bases plus saines. Il n’existe que peu de travaux dans la littérature sur ce thème. Nous avons pu décrire la présence d’APEX, enzyme de réparation de l’ADN dans les ovocytes humains.

La bêta polymérase a également été décrite dans l’ovocyte de brebis.

M. Bernard HILLEMAND

Peut-on faire un rapprochement entre l’action ici signalée de l’hypotaurine et celle de l’homotaurinate de calcium pour laquelle, avec mon équipe, nous avions montré l’intérêt dans le traitement de l’alcoolisme, l’alcool étant un grand fournisseur de radicaux libres.

Encore une fois les anti-oxydants, surtout soufrés, sont d’un intérêt majeur, pourvu qu’un certain équilibre physiologique soit respecté. Mais il est plutôt admis que l’homotaurine agit plutôt comme agoniste GABA au niveau central.

Bull. Acad. Natle Méd., 2005, 189, no 4, 715-728, séance du 19 avril 2005