Communication scientifique
Session of 25 janvier 2005

Modèle canin de l’épidermolyse bulleuse dystrophique (EBD) de l’homme. Caractérisation et mise au point d’un protocole de thérapie génique

MOTS-CLÉS : dermatoses héréditaires. épidermolyse, bulleuse dystrophique/ génétique. modèles animaux. thérapie génique.
Characterization of a canine model of dystrophic bullous epidermolysis (DBE). Development of a gene therapy protocol
KEY-WORDS : epidermolysis bullosa dystrophica/genetics. gene therapy.. models, animal. skin disease, genetics

Jean-Pierre Magnol, Didier Pin, Xavier Palazzi, Jean-Philippe Lacour**, Yannick Gache** et Guerrino MENEGUZZI**, Guerrino Meneguzzi**

Résumé

L’existence des principales formes d’épidermolyse bulleuse décrites dans l’espèce humaine (EB simple, EB jonctionnelle, EB dystrophique) est attestée, avec plus ou moins de précisions, chez les animaux de rente (ruminants petits et grands, chevaux) et de compagnie (chats, chiens). Dans l’espèce canine (Golden Retriever) l’EB dystrophique (EBD) a fait l’objet d’une description récente complète éclairant les aspects cliniques, morphologiques et génétiques. L’expression clinique est dominée par la présence de lésions bulleuses et érosives de la peau glabre (abdomen, face interne des oreilles…) et des muqueuses buccale et oesophagienne. Elles s’accompagnent de grains de milium, de dystrophies unguéales et d’un retard de croissance. Les techniques habituelles de microscopie (photonique et électronique, immunofluorescence indirecte) révèlent des anomalies des fibrilles d’ancrage et une expression très faible et désorganisée du collagène de type VII.. La mutation du gène COL7A1 canin (dont la séquence nucléotidique présente 87,8 % d’homologie avec celle de l’homme) consiste en un changement d’une guanine en adénine à la position 5716, induisant dans la séquence des acides aminés la substitution d’une glycine par une sérine en position 1906 ( mutation G1906S). Sa transmission au sein de l’élevage s’opère sur le mode récessif (EBDR). L’ensemble de ces caractéristiques rapproche ainsi l’EBDR du Golden Retriever de certaines formes d’EBD de l’homme, en particulier celles de phénotype intermédiaire entre « gravis » (forme dite de Hallopeau-Siemens) et « mitis ». L’absence actuelle de traitement curatif des EB de l’homme invite à évaluer l’intérêt d’un protocole de thérapie génique conduit chez l’animal. Les premières étapes (élaboration d’un vecteur viral recombinant apte à insérer le gène sauvage au sein du génome kératinocytaire, greffe à la souris Nude d’une peau artificielle contenant les kératinocytes canins transfectés…) ont été franchies avec succès. Reste néanmoins la question centrale d’une éventuelle immunogénicité du produit du transgène et de la persistance de son expression in vivo chez des sujets au système immunitaire fonctionnel. C’est dans le but d ‘éclairer ce point précis que nous nous proposons d’utiliser le modèle Golden Retriever.

Summary

The main human forms of epidermolysis bullosa (EB), namely EB simplex, junctional EB and dystrophic EB, have also been described in domestic animals (small and large ruminants, and horses) and companion animals (cats and dogs). A recent description of dystrophic epidermolysis bullosa (DEB) in Golden Retriever dogs provided details of the principal clinical, morphological and genetic features. The disease is characterized by blisters and erosions in the oral and esophageal epithelia, together with milia, nails dystrophy and growth retardation. The cutaneous lesions regress spontaneously in adult dogs, whereas the epithelial lesions persist, aggravate and spread, notably to the cornea. Classical microscopic studies (light and electron microscopy, indirect immunofluorescence) have revealed anchoring fibril abnormalities and very low-level and heterogenous expression of collagen type VII. The culprit mutation (G1906S) in the canine gene COL7A1 (87.8 % nucleotide sequence identity to the human counterpart) involves the replacement of guanine 5716 by adenine, leading to glycine substitution by serine at amino acid position 1906. Transmission in kennels occurs in recessive mode (RDEB). These features recall certain human forms of DEB, and particularly those with a phenotype intermediate between gravis (the so-called Hallopeau-Siemens form) and mitis. No curative treatment of human EB is currently available, and efforts are therefore being made to develop a gene therapy protocol in animals. The first steps have already been successfully achieved, namely the development of a recombinant virus vector able to insert the wild-type gene into the keratinocyte genome, and grafting of artificial skin containing transfected canine keratinocytes in nude mice. The recombinant vectors are Moloney-type retroviruses (MMLV-PCMV), and the Zeocin resistance gene is used to select transduced cells. The artificial skin reconstructed in vitro is of the full-thickness type. Despite the large size of the transduced (9 kb), 95 % of cells are transduced and produce large amounts of wild-type collagen. Two key issues remain, however : the possible immunogenicity of the transgene product and the persistence of transgene expression in individuals with a functional immune system. Golden Retriever dogs will provide a suitable animal model for these studies.

Lexique :

ADNc : ADN complémentaire BP 230 et BP 180 : Antigènes 1 et 2 de la pemphigoïde bulleuse.

EB : Épidermolyse bulleuse.

EBD : Épidermolyse bulleuse dystrophique.

EBDD : Épidermolyse bulleuse dystrophique dominante.

EBDR : Épidermolyse bulleuse dystrophique récessive.

EBJ : Épidermolyse bulleuse jonctionnelle.

ENVL : École Nationale Vétérinaire de Lyon.

GR : Golden Retriever JDE : Jonction dermo-épidermique (membrane basale).

MMLV : Murine Moloney Leukemia Virus.

PCMV : Embryonal Carcinoma Cell-passage Myeloproliferative Sarcoma Virus.

INTRODUCTION

Les épidermolyses bulleuses (EB), groupe complexe de dermatoses mécanobulleuses, localisées ou généralisées et de sévérité variable, résultent d’anomalies des constituants moléculaires de la jonction dermo-épidermique (JDE) dont la transmission génétique se fait sur le mode dominant ou récessif. Trois formes principales sont reconnues dans l’espèce humaine : l’EB simple ou épidermolytique (EBS), l’EB jonctionnelle (EBJ) et l’EB dystrophique ou dermolytique (EBD). Les différentes formes d’EBS sont, pour l’essentiel 1, liées à des mutations des gènes codant pour les cyto-kératines 5 et 14 qui, à l’état normal, entrent dans la composition du cytosquelette (tonofilaments) des kératinocytes de l’assise basale [fig.1]. Les défauts d’assemblage qui en résultent fragilisent les kératinocytes aux agressions mécaniques. Il existe plusieurs formes d’EBJ résultant de mutations des gènes codant pour l’inté- grine α6β4, l’antigène BP180 (collagène XVII) et surtout la laminine 5, principal constituant des filaments d’ancrage. Défectueuse, elle autorise un clivage entre kératinocytes et lamina densa [fig.1]. Toutes les formes d’EBD enfin [Tableau I], sont dues à des mutations du gène COL7A1, codant pour le collagène de type VII, principal constituant des fibrilles d’ancrage, boucles grossièrement semi-circulaires disposées à la façon d’un « surjet » entre lamina densa (collagène de type IV) et collagène dermique (types I et III). La zone de fragilité se situe alors au-dessous de la lamina densa [fig.1] que l’on retrouve, en histopathologie, au toit de la bulle.

Les trois formes principales attestées dans l’espèce humaine ont été signalées chez l’animal domestique, avec un degré de confiance variable en fonction de la nature des moyens mis en œuvre pour valider le diagnostic. L’EBS est décrite dans les espèces canine et bovine. Les publications concernant les chiens (de race Colley et Shetland) ne reposent que sur des arguments présomptifs (âge, clinique, histologie classique) et le diagnostic différentiel d’avec une dermatomyosite demeure hésitant [1, 2]. En revanche, l’EBS suspectée chez 25 veaux ayant pour géniteur un taureau de race Simmentale, est beaucoup plus convaincante, bien qu’aucune recherche d’ordre immunohistochimique ou génétique n’ait pu être réalisée [3].

L’EBJ est connue dans les espèces équine, bovine, féline et canine. Pour les poulains de race Belge et Comtoise, les publications relatant la présence d’une mutation génétique sur la chaîne γ2 de la laminine 5 confirment les argumentations anatomocliniques en particulier ultrastructurales [4, 5, 6, 7, 8]. Chez le bœuf charolais 1. Si l’on excepte une EBS associée à une atrophie musculaire et qui reconnaît pour origine une mutation du gène de la plectine.

FIG. 1. — La JDE : composition ultra structurale, moléculaire et niveaux de clivage.

l’étiologie de l’EBJ n’est pas encore clarifiée. Si le cas décrit chez un chaton Européen est plausible [9], c’est dans l’espèce canine que l’on trouve les descriptions d’EBJ les mieux documentées, en particulier chez des chiots de race Braque Allemand souffrant d’une mutation sur la chaîne α3 de la laminine 5 [10, 11].

L’EBD est signalée chez les ruminants (petits et grands) et chez les carnivores domestiques. Chez les moutons [12, 13, 14], son existence est suspectée en Écosse (race Scottish black face), en Nouvelle-Zélande (races Suffolk et South Dorset

TABLEAU I. — Les principales formes d’EDBD chez l’homme.

Down) et démontrée en Suisse chez des sujets de race Weisses Alpenschaf (EBD récessive sévère, comparable à la forme « gravis », dite d’Hallopeau-Siemens chez l’homme). Chez les grands ruminants une EBD probable a été décrite au Texas chez trois veaux de race Brangus [15]. L’espèce féline a fourni plusieurs observations mais seule la dernière en date [16], concernant la race persane, est convaincante sur la foi des résultats de la ME et de l’immunofluorescence. Dans l’espèce canine enfin, l’existence d’une EBD, écartée chez l’Akita [17] où elle reconnaît une origine auto-immune, possible chez le Beauceron [18], est prouvée chez le Golden Retriever [19].

L’EBD de l’Homme et du Golden Retriever (GR), validité du modèle animal :

L’EBD de l’Homme

Notre propos se limite volontairement à une présentation schématique de ses principales caractéristiques de façon à évaluer le degré d’homologie de l’affection canine avec les variantes reconnues chez l’homme (Tableau I). Les atteintes sévères (généralisées) récessives (EBDR) regroupent la forme « gravis » dite d’HallopeauSiemens (H.S.) et la forme « mitis ». Les lésions de la forme H.S apparaissent dès la naissance et siègent sur la peau et les muqueuses. Les éruptions cutanées bulleuses suivies d’érosions stigmatisent l’ensemble du corps, particulièrement l’extrémité des membres, à l’origine de cicatrices atrophiantes et invalidantes (pseudosyndactylies et contracture des membres en flexion…). Les grains de milium sont présents, les ongles souvent absents. Les lésions de la muqueuse buccale (érosions, microstomie, ankyloglossie) et oesophagienne (érosions puis sténose), en perturbant la prise alimentaire et la déglutition, sont responsables d’une anémie et d’un retard staturopondéral. Les pertes de substance peuvent intéresser d’autres muqueuses : voies
urinaires et génitales, conjonctive, cornée… Le décès survient habituellement au cours des trois premières décennies. Dans la forme dite « mitis » les lésions sont moins sévères, en particulier les atteintes muqueuses, limitées à des érosions buccales. En conséquence, on n’observe ni retard de croissance, ni anémie.

Le gène COL7A1 de l’homme, situé sur le chromosome 3, code pour 2944 acides aminés (1253, 1530, 161 pour — respectivement — les domaines NC1, triple hélice et NC2). Il a été cloné, séquencé et ses mutations, dominantes (D) ou récessives (R) — plus de 300 — répertoriées 2 [20, 21]. Elles affectent la synthèse et la sécrétion du procollagène VII (monomère) ou perturbent l’assemblage des dimères en fibrilles d’ancrage. La ME et l’IF [22, 23] révèlent en conséquence un large éventail d’anomalies structurales du collagène de type VII, qui peut être diminué (« hypoplasique »), absent et parfois séquestré au sein du cytoplasme kératinocytaire. Les importantes variations de nature et/ou d’intensité qui caractérisent ce déficit soustendent le polymorphisme clinique, les nombreuses formes d’EBD étant classées en fonction de la sévérité des lésions, de leur distribution (formes localisées /généralisées, atteinte cutanée / cutanéo-muqueuse) et de leur mode de transmission, dominant (EBDD) ou récessif (EBDR).

L’EBD canine

Matériel et méthodes

Biopsies

Des biopsies cutanées et muqueuses ont été réalisées à l’aide d’un trépan, en périphérie des lésions. Celles destinées à un examen histopathologique classique, ont été fixées dans du formol, incluses en paraffine, coupées à 4 µm, pour différentes colorations et réactions (hématoxyline-éosine et PAS). D’autres, destinées à l’étude immunohistochimique, ont été placées dans de l’OCT, puis congelées en les plongeant dans un bain-marie d’isopentane dans l’azote liquide, et conservées dans de l’azote liquide. Des sections de 4 µm ont été réalisées au cryostat et utilisées pour les immunomarquages.

Immunomarquages

Les anticorps utilisés ont été les suivants :

• Anticorps monoclonal (Acm) LH-7.2 dirigé contre le domaine NC1 du collagène VII (Chemicon, Temecula, CA), 2. La plupart des mutations à l’origine des différentes formes d’EBDD de l’homme sont des changements d’une seule base (guanine/adénine par exemple), aboutissant à des substitutions de la glycine des triplets (Glycine-X-Y) de la triple hélice. Les EBDR résultent de mutations non-sens ou de mutations dans les sites d’épissage du gène entraînant l’absence ou l’expression anormale du collagène de type VII.

• Anticorps polyclonaux (Acp) de lapin SE85, β3B et SE144, dirigés respectivement contre les chaînes α3, β3 et γ2 de la laminine 5, • Acp GOH3 dirigé contre l’intégrine α6, • Acm 233 dirigé conte le collagène XVII (BP 180), • Acp L9393 dirigé contre la laminine 1 (Sigma, Aldrich).

La spécificité de ces anticorps pour leur cible supposée chez le chien a été systématiquement vérifiée par comparaison avec les marquages sur peau canine saine. Le marquage a été réalisé à l’aide d’anticorps de chèvre, anti-Ig de souris ou anti-Ig de lapin, conjugués au fluorochrome FITC (Dako SA,Trappes, France).

Préparation de l’ADN canin et identification de la mutation

Des fragments chevauchants de l’ADNc canin codant pour le collagène VII ont été obtenus par amplification, à l’aide de la technique RT-PCR, à partir d’un extrait total des ARNm de kératinocytes canins sains et mutés [25].

Cultures cellulaires

Des kératinocytes et des fibroblastes canins épidermiques et muqueux, obtenus à partir de biopsies cutanées et muqueuses des chiens malades et de témoins sains, ont été cultivés comme décrit antérieurement [25].

Transduction des kératinocytes mutés à l’aide de vecteurs rétroviraux

La réversion phénotypique des kératinocytes mutés a été obtenue par transduction du gène codant pour le collagène VII canin à l’aide de vecteurs rétroviraux dérivés de MMLV, comme détaillé précédemment [25].

Aspects cliniques et évolution

Deux chiots Golden Retriever (GR), un mâle et une femelle, âgés de deux mois environ et provenant de deux portées différentes issues du même élevage présentent, dès la première consultation [19, 24] :

— des lésions buccales : bulles flaccides fragiles à contenu séro-hémorragique et exulcérations, larges et nombreuses, intéressant surtout le palais, les gencives et la face interne des joues. Les régurgitations, le ptyalisme et l’infection secondaire sont notables accompagnés d’halitose et d’adénopathies rétro-mandibulaires.

L’examen endoscopique révèle l’extension des lésions à la muqueuse oesophagienne.

Ces érosions muqueuses ont été observées dès la naissance et même in utero pour le sujet mâle obtenu par césarienne, — des lésions cutanées, sous forme d’érosions et de grains de milium (grutum) bien visibles dans les régions glabres (abdomen, aine, face interne des pavillons auriculaires…),
— des dystrophies unguéales avec onychomadèse (perte spontanée de l’étui corné), — un retard de croissance (imputable, selon toute vraisemblance, aux lésions du haut appareil digestif), un prognathisme.

Les examens hématologiques et biochimiques de routine sont normaux à l’exception d’une discrète anémie normocytaire normochrome régénérative et d’un pic électrophorétique des globulines α2.

Ces deux animaux, adoptés par des étudiants de l’ENV Lyon, sont à l’heure actuelle en bon état général mais — en dépit de leur statut d’adulte = 3.5 ans — de petite taille. Les grains de milium et les lésions cutanées ont spontanément régressé, à l’exception toutefois des érosions de la face interne des pavillons auriculaires.

Aucune lésion tumorale de type carcinome épidermoïde n’est, pour l’heure, détectée. En revanche, les deux sujets perdent régulièrement leurs griffes, les érosions buccales sont toujours présentes, de même que celles de siège œsophagien, sévères et à l’origine d’une fibrose cicatricielle perturbant le fonctionnement du cardia (béance et reflux gastro-oesophagiens constants). La femelle enfin a présenté un ulcère cornéen accompagné de blépharospasme ainsi que de nombreuses caries dentaires [24].

Histopathologie (ENVL), Immunofluorescence, Microscopie électronique (Inserm U 385) Les bulles de siège buccal résultent d’un clivage dermo-épidermique profond (dermolytique) en regard d’un derme silencieux, excepté pour les zones exulcérées. La réaction au PAS révèle que la JDE se situe, dans sa totalité (lamina densa comprise), au toit de la bulle. L’examen en IF indirecte sur tissus congelés, utilisant plusieurs anticorps couplés à un fluorochrome, confirme les données du PAS et révèle l’expression très faible et désorganisée du collagène de type VII le long de la JDE , en particulier pour les muqueuses buccale et œsophagienne. Par ailleurs quelques fibroblastes et kératinocytes nettement positifs suggèrent sa rétention intracytoplasmique partielle 3. La ME cible un niveau de désengrènement compatible avec une EBD ainsi que des anomalies des fibrilles d’ancrage (plus courtes et moins bien définies que chez l’homme) mais ces observations sont sujettes à controverses en l’absence d’images de référence [19, 24].

Étude génétique (Inserm U634)

L’ADNc canin correspondant au procollagène de type VII a été obtenu par transcription inverse à partir d’ARN totaux extraits de cultures de kératinocytes normaux et pathologiques permettant la comparaison des séquences entre animaux sains et malades.

3. Ces données ont été confirmées par IF sur cultures de kératinocytes sains et pathologiques et par Western-blots utilisant des lysats de kératinocytes mutés.

La séquence nucléotidique du gène

COL 7A1 canin code pour 2936 acides aminés (1253, 1523, 160 pour — respectivement — les domaines NC1, triple hélice et NC2) et présente 87,8 % d’homologie avec celle de l’homme et 82 % seulement avec celle de la souris. La mutation responsable de l’épidermodysplasie consiste en un changement d’une guanine en adénine à la position 5716, induisant dans la séquence des acides aminés la substitution d’une glycine par une sérine à la position 1906 (mutation G1906 S). Le domaine collagénique perturbé se situe en amont de l’interruption non collagénique principale (« hinge » constituée de 36 aa chez le chien contre 39 dans l’espèce humaine. Fig.2). Comme chez l’homme en effet, on identifie, pour le monomère du collagène de type VII, trois domaines principaux : le domaine collagénique flanqué des domaines NC1 amino-terminal et NC2 carboxy-terminal codés, respectivement, par 4569, 3759 et 480 nucléotides.

L’étude de la transmission de la mutation dans l’élevage a été réalisée après obtention du profil génétique (sain, porteur sain, malade) 4 pour dix animaux (2 sujets à l’origine de la description princeps + 8). Les résultats obtenus montrent que les sujets EBD sont homozygotes (2 allèles mutés), tandis que les porteurs sains sont hétérozygotes (1 allèle sauvage + 1 allèle muté [19, 24]). L’hypothèse d’une transmission sur le mode récessif (EBDR) était d’ailleurs prévisible compte tenu du caractère cliniquement indemne des parents et de la fratrie.

Validité du modèle animal d’EBDR / GR

Si l’on compare les caractéristiques anatomo-cliniques de l’EBDR / GR aux diffé- rentes formes d’EBD individualisées dans l’espèce humaine, de nombreuses analogies la rapprochent de l’EBD humaine de Cockayne-Touraine, mais cette dernière se transmet sur le mode dominant (Tableau I). Si l’on se réfère maintenant aux EBDR de l’homme, la forme « gravis » (= Hallopeau-Siemens) semble trop sévère (pseudosyndactylies et espérance de vie diminuée chez l’homme) et la forme « mitis » insuffisamment (chez l’homme toujours, la croissance est normale et les lésions muqueuses pratiquement absentes). En somme, les contours de l’EBDR / GR, empruntés tant à la forme « gravis » qu’à la forme « mitis », ne se superposent que partiellement à ceux des principales formes d’EBDR généralisées de l’homme. Ce statut clinique « intermédiaire » de l’EBDR canine se retrouve aussi morphologiquement, les anomalies du collagène VII 5 se rapprochant, pour les muqueuses et la peau, de celles estimées-respectivement-sévères et peu sévères dans l’espèce humaine. Il a été constaté enfin que les gènes COL7A1 humain et canin codant pour 4. La mutation G1906S supprimant un site de restriction pour l’endonucléase HaeIII, l’analyse électrophorétique sur gel des produits de digestion enzymatique peut ainsi servir de « marqueur » (fragments de 127, 95+32, 127+95+32 pb pour, respectivement, les sujets malades, sains et porteurs sains).

5. La rétention du collagène de type VII au sein du cytoplasme kératinocytaire est rencontrée dans une forme particulière d’EBDD généralisée, la dermolyse bulleuse transitoire du nouveau-né. Elle se distingue cependant de notre entité pour laquelle persistent des lésions muqueuses sévères.

FIG. 2. — Morphologie et domaines du procollagène de type VII. Position de la mutation canine G 1906 S du gène COL7A1.

le collagène de type VII sont très proches (87,8 % d’homologie pour la séquence nucléotidique) et que la mutation canine G1906 S est du type substitution homozygote de la glycine. Comme les patients humains atteints d’une même forme d’EBD ne reconnaissent pas toujours les mêmes mutations, il s’avère intéressant de comparer les génotypes et les phénotypes, plutôt que les phénotypes entre eux. On constate alors que les malades qui reconnaissent une substitution de la glycine à l’état homozygote expriment soit un phénotype sévère soit un phénotype intermédiaire entre la forme « gravis » et la forme « mitis », du type de celui observé chez nos deux GR. Par ailleurs l’atteinte préférentielle des muqueuses correspond à un phénotype particulier d’EBDR lié à une « instabilité » du collagène de type VII muté, reconnu tant dans l’espèce humaine [26] que chez le GR. L’EBDR /GR se révèle donc proche, dans ses aspects cliniques, évolutifs, morphologiques et génétiques de certaines formes d’EBDR de l’homme, en particulier de celles de phénotype intermédiaire entre « gravis » et « mitis », avec atteinte préférentielle des muqueuses [26] et nous semble constituer un modèle animal intéressant de pathologie spontanée.

Mise au point d’un protocole de thérapie génique

L’absence de traitement médical ou chirurgical curatif pour nombre de génodermatoses a fait placer tous les espoirs dans la thérapie génique des cellules somatiques.

La maîtrise d’un ensemble de techniques (culture ex vivo des cellules souches
épidermiques, élaboration d’un vecteur viral recombinant apte à insérer le gène sauvage au sein du génome kératinocytaire, mise au point d’une peau artificielle autologue constituée pour partie des kératinocytes transfectés…), a fait de la peau humaine, souffrant d’ichtyose lamellaire liée à l’X, de xeroderma pigmentosum ou d’EB, un tissu cible privilégié pour la thérapie génique, malgré les risques potentiels encourus 6.

Prenant en compte l’expérience acquise chez le Braque Allemand atteint d’EBJ non létale [27], nous avons retenu un protocole voisin articulé en plusieurs étapes :

Culture ex vivo de fibroblastes et de kératinocytes canins épidermiques et muqueux EBDR, — Transduction-sélection : transduction d’un gène curatif COL7A1 pour les kératinocytes EBDR, à l’aide de vecteurs rétroviraux de type Moloney (MMLV-

PCMV), l’un d’entre eux portant le gène de résistance à la Zéocine ce qui autorise la sélection des cellules transduites. L’ADNc codant pour le collagène de type VII est inséré au niveau du site de restriction EcoRI, tandis que les gènes codant pour les protéines virales sont délétés, rendant l’encapsidation impossible, — Mise au point d’une peau artificielle reconstruite in vitro , de type « fullthickness ». Comme dans le modèle Del Rio [28], les kératinocytes transfectés sont ensemencés sur une matrice de fibrine renfermant un semis de fibroblastes canins vivants, — Greffe de la peau artificielle à des souris immunodéficientes (Nude). Les xénogreffes sont maintenues in situ à long terme et fournissent des biopsies itératives qui permettent d’apprécier la quantité et la qualité du collagène canin de type VII exprimé en l’absence d’un gène de sélection.

Ces étapes précliniques ont été franchies avec succès : pourcentage important de cellules transduites (95 %) en dépit de la taille importante du transgène (9kb), taux de sécrétion élevé d’un collagène VII de type sauvage détecté au sein de la JDE des peaux artificielles construites in vitro .

Des questions restent néanmoins en suspens, en particulier celle, centrale, d’une éventuelle immunogénicité du produit du transgène [29] et de la persistance de son expression in vivo chez des animaux au système immunitaire fonctionnel. La greffe de cette peau artificielle à des chiens immunocompétents souffrant d’EBDR spontanée devrait apporter des éléments de réponse à ces interrogations et peut-être autoriser, pour les formes cutanées localisées et invalidantes de l’enfant, et en l’absence de thérapeutiques alternatives, la mise en œuvre d’essais cliniques de phase I / II.

6. Dans l’hypothèse d’une manifestation de rejet ou de transformation du greffon l’excision serait, pour cet organe accessible qu’est la peau, pratiquée précocement et facilement.

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DISCUSSION

M. Jean CIVATTE

Y a t-il, chez le chien, comme on le voit chez l’homme, d’une part des lésions atrophocicatricielles plus ou moins mutilantes et, d’autre part, des lésions plus discrètes observées dans les formes « bénignes » ?

Les cicatrices mutilantes des extrémités des membres ne font pas partie du tableau clinique de notre observation princeps. Ce constat ne manque pas de surprendre si l’on songe que les coussinets plantaires constituent des zones mécaniquement très sollicitées et largement lésées dans d’autres modèles d’EB, comme l’EB jonctionnelle du Braque Allemand. Manquent également, à ce jour, les complications tumorales (carcinome épidermoïde). Le modèle canin associe des lésions muqueuses (bouche, œsophage…)
pérennes, préoccupantes, à l’origine d’un net retard staturo-pondéral et des lésions (exulcérations, grains de milium…) de siège cutané (zones glabres) souvent discrètes et d’évolution favorable.

M. Charles PILET

Quel type de cytokines avez-vous utilisé pour la culture de kératinocytes ?

Nous utilisons en pratique un milieu approprié, le DMEM (Dulbecco’s modified eagle’s medium) enrichi en glucose et additionné de sérum de fœtus bovin, d’acide ascorbique…

La littérature signale toutefois une synthèse importante de collagène VII par les co-cultures in vitro lors d’utilisation de cytokines : TG-β et TNF-α ou encore TGF-β et

IL-1β.

M. Jacques EUZEBY

Le modèle « chien » étudié était-il composé de cas spontanés ou d’E.B. provoquée ? Sauf erreur de ma part, le substrat histologique de l’E.B. est semblable à celui de l’eczéma. Or on pense que l’eczéma vrai n’existe pas chez le chien. L’existence d’une E.B. spontanée permet-elle de contredire cette assertion ? Vous avez procédé à des essais thérapeutiques sur des souris immuno-déficientes ; qu’en serait-il avec des souris immuno-compétentes ?

Le modèle canin présenté est constitué de deux cas spontanés (un mâle et une femelle), désormais à l’origine d’une lignée.

La vésicule de l’eczéma est une cavité intra-épidermique résultant d’une exosérose et d’une spongiose. La bulle de l’EBD, en revanche, épargne le massif épidermique intact et implique une protéine défectueuse (le collagène VII) de la JDE.

Les greffes de peaux reconstruites, pratiquées chez la souris Nude dans le but d’apprécier, sur le long terme, la sécrétion du collagène VII transgénique, doivent être complétées par leur mise en œuvre chez l’animal immunocompétent. Notre modèle canin d’EBD spontanée nous a paru constituer un choix judicieux.

M. Bernard PESSAC

Quelles sont les raisons de votre grande inquiétude quant au rejet éventuel des greffes exprimant le collagène VII « sauvage » ?

Au cours des essais précliniques de thérapie génique, il a été observé un manque d’expression sur le long terme des produits du transgène, dû à la stimulation d’une réponse immunitaire contre ces produits (et/ou, en fonction des vecteurs utilisés, contre les produits du vecteur viral). Cette réponse immunitaire élimine rapidement les cellules transduites. Dans le cas des chiens EBD, bien que le produit du transgène introduit (collagène VII sauvage) ne diffère du collagène VII endogène que par un acide aminé, cette modification devrait entraîner un changement dans la conformation tridimentionnelle de la protéine. Ce changement de conformation pourrait exposer des sites non reconnus par le système immunitaire de l’hôte et entraîner une réponse avec rejet des greffes successives.

M. Jacques BAZEX

Le collagène VII est synthétisé et sécrété par les kératinocytes, mais l’intervention du fibroblaste serait nécessaire pour que les fibres d’ancrage soient présentes et fonctionnelles.

Ne pensez-vous pas qu’insérer le gène au sein du kératinocyte sans pouvoir impliquer le fibroblaste soit insuffisant pour obtenir de bons résultats cliniques ?

Le collagène VII est, en effet, synthétisé et sécrété par les kératinocytes et, à un moindre degré, par les fibroblastes du derme papillaire et du chorion muqueux. Les co-cultures assurent une production quantitativement plus importante, dans un délai de 9 jours (14 jours pour une expression complète), ce qui suggère l’existence d’interactions épithéliomésenchymateuses. L’idéal serait probablement de transfecter les kératinocytes et les fibroblastes, ce qui impliquerait pour ces derniers l’utilisation de vecteurs lentiviraux dont nous n’avons pas l’expérience.

M. Christian NEZELOF

Le collagène VII est-il l’exclusivité des kératinocytes ? Sa production est-elle plus ubiquitaire ? Les animaux atteints sont-ils victimes de lésions squelettiques ? Concernant les co-cultures de kératinocytes/fibroblastes, quelle est l’origine des fibroblastes constituant le feeder-layer de ces co-cultures ?

Dans l’espèce humaine, le collagène VII est synthétisé par les kératinocytes et les fibroblastes du derme et du chorion des muqueuses à épithélium stratifié. Il en est de même chez le chien souffrant d’EBD où les immunomarquages (Acm LH-7.2 antidomaine NC1) ont révélé une rétention intracytoplasmique pour ces deux familles cellulaires. Pour les co-cultures kératinocytes-fibroblastes, les fibroblastes du « Feederlayer » ont une origine murine. La cartographie précise du collagène VII reste à tracer chez le chien sain et souffrant d’EBD pour lequel, à ce jour, aucune anomalie squelettique cliniquement exprimée, n’est à signaler.


* Membre correspondant de l’Académie nationale de médecine. ** U364 INSERM. Tirés-à-part : Professeur Jean-Pierre MAGNOL, 22 chemin du Maréchal, 69250 POLEYMIEUX au Mont d’Or. Article reçu le 6 juillet 2004, accepté le 29 novembre 2005.

Bull. Acad. Natle Méd., 2005, 189, no 1, 107-121, séance du 25 janvier 2005