Communication scientifique
Séance du 20 mars 2012

Les protéines DING : propriétés biochimiques, structurales et capacité à inhiber la réplication du virus VIH-1

MOTS-CLÉS : protéines de liaison aux phosphates. vih
Ding proteines, their biochemical and structural properties and their ability to inhibit HIV-1 replication
KEY-WORDS : hiv. phosphate-binding proteins

Eric Chabrière * Mikael ELIAS **, Mikael Elias **, Julien Hiblot *, Ahmed Djeghader *, Christian Schwartz déclarent avoir déposé un, Olivier Rohr et Christian Schwartz déclarent avoir déposé un, Patrick Masson ****

Résumé

Les protéines DING constituent une intrigante famille de protéines fixatrices de phosphate, identifiées dans les différents règnes du vivant, i.e. les procaryotes, les archaea et les eucaryotes. En dépit de leur caractère ubiquitaire chez les eucaryotes, aucun locus ni ORF n’a été identifié à ce jour dans les génomes séquencés. Cette particularité a considérablement freiné les études structurales et fonctionnelles sur ces protéines, et a nécessité la mise en place de méthodologies innovantes, comme lors du séquençage de l’une de ces protéines par spectrométrie de masse et cristallographie des rayons X. L’obtention de structures cristallographiques à très haute résolution a permis d’élucider le mécanisme moléculaire de fixation du phosphate chez ces protéines de haute affinité. Par ailleurs, malgré le problème génétique associé à ces protéines, elles ont été trouvées par immunohistochimie dans une grande variété de tissus eucaryotes. Enfin, certaines de ces protéines, dont la Human Phosphate-Binding Protein, sont capables d’inhiber la réplication du VIH. Cette inhibition s’exerce sur l’étape de transcription du virus, non encore ciblée par les thérapies actuelles, ce qui ouvre la voie au développement potentiel de nouvelles stratégies pour le traitement de l’infection au VIH.

Summary

DING proteins comprise an intriguing phosphate-binding protein family present in all animal phyla. Five different DING representatives have been described in humans. Eukaryotic DING proteins are mostly involved in cellular processes such as cell cycle regulation, and also in pathological process such as rheumatoid arthritis and kidney stone formation. Although these proteins are ubiquitous in eukaryotes, no relevant locus or ORF has yet been found in sequenced genomes. This lack of sequence information has considerably hampered functional and structural studies of these proteins, and has required the use of novel and original techniques such as ab initio protein sequencing based on a combination of X-ray crystallography and mass spectrometry. Sub-A Í ngstrom structural resolution has elucidated the molecular binding mechanism of phosphate ions by these high-affinity proteins. Immunohistochemical studies show that these proteins are present in a wide variety of mouse tissues. Some DING proteins, particularly human phosphate binding protein (HPBP), can inhibit HIV replication. This inhibition takes place at the transcriptional step, which is not targeted by any current antiretroviral drug. Initial studies suggest that HPBP warrants animal testing. This recent discovery opens new possibilities for the treatment of HIV infection.

Les protéines DING

Les protéines DING constituent une famille de protéines intrigante, nommée ainsi en raison de leur séquence N-terminale DINGGG- particulièrement conservée [1].

La première protéine DING fut découverte chez l’homme [2], et depuis, d’autres membres de cette famille de protéines ont été identifiés dans les différents règnes du Vivant [3, 4]. Jusqu’à présent, environ quarante différents représentants de cette famille ont été isolés, principalement à partir d’organismes eucaryotes [5]. Pourtant, les gènes codant ces protéines chez les eucaryotes n’ont pas encore été identifiés, et ce, y compris chez l’homme, dont le génome est séquencé [5]. Les divers et nombreux essais visant à cloner ou séquencer ces gènes se sont, jusqu’à présent, révélés infructueux. Néanmoins, certaines séquences d’acides nucléiques ont pu être amplifiées chez l’homme et certaines plantes [3]. Malheureusement, l’information génétique disponible concernant les protéines DING consiste, pour l’heure, en des fragments d’ADN partiels (pas de gènes complets, d’ORF ou de loci définis), ainsi que des séquençages peptidiques, principalement des séquences N-terminales et quelques peptides internes [3]. Ce manque d’information génétique a considérablement freiné et compliqué les travaux sur les protéines DING eucaryotes. De façon remarquable, ces séquences disponibles montrent une conservation de séquence très importante, y compris pour des espèces distantes d’un point de vue évolutif. Ainsi, les séquences nucléotidiques codant les protéines DING issues de la pomme de terre (une plante supérieure) et de Leishmania major (un protozoaire) possèdent une identité de séquence d’environ 90 %, et ce sur plus de 600 paires de bases [6]. Un tel niveau de conservation ne peut s’expliquer uniquement par l’importance de la seule fonction des protéines DING.

Chez l’homme, au moins cinq protéines DING différentes ont été décrites, et le plus souvent mises en relation avec certaines pathologies humaines voire certains processus biologiques. Les fragments de séquences connus pour ces cinq protéines divergent considérablement, si bien qu’il est plus vraisemblable qu’elles correspondent à des gènes différents, plutôt qu’à un polymorphisme ou un mécanisme d’épissage alternatif [3]. L’une de ces protéines, la Synovial Stimulatory Protein (SSP) fut la première protéine DING découverte, et semble liée aux mécanismes de l’arthrite rhumatoïde, possédant une activité auto-antigène [2]. Une autre protéine, la Crystal Adhesion Inhibitor (CAI), est décrite comme capable d’inhiber la formation des calculs rénaux [7]. La Steroidogenesis-Inducing Protein (SIP), isolée par Khan et al .

(1997), est capable d’influencer le cycle cellulaire, notamment par une activité mitogène sur certaines lignées cellulaires épithéliales [8]. Une étude plus récente sur des lymphocytes T4 résistants à l’infection du VIH-1 a conduit à l’isolation d’une nouvelle protéine DING, nommée X-DING CD4+, qui est capable d’inhiber la réplication du VIH-1 [9]. Enfin, la Human Phosphate-Binding Protein (HPBP) fut découverte fortuitement à partir de plasma humain lors d’études structurales sur la paraoxonase humaine (HPON1) [6, 10], une enzyme plasmatique associée à la lipoparticule de HDL et qui possède une activité anti-athérogénique [11]. Les deux protéines sont en effet associées in vitro et in vivo [12-14], et leur association est essentielle à leur stabilité mutuelle [15, 16]. La séquence protéique de HPBP fut déterminée expérimentalement en combinant les données issues des cartes de densité électronique et les séquences obtenues par spectrométrie de masse MS/MS [17].

L’obtention de cette première séquence complète de protéine DING eucaryote a confirmé l’absence de gènes correspondant dans le génome humain séquencé.

Localisation tissulaire et différentes isoformes de protéines DING

Grâce à l’obtention de la séquence complète de HPBP [17], plusieurs anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre cette protéine ont pu être obtenus.

Conséquence de la très grande identité de séquence entre protéines DING, les anticorps polyclonaux sont capables de reconnaitre d’autres protéines DING. Cette particularité fut utilisée pour caractériser et déterminer la présence et la localisation tissulaire des protéines DING de façon systématique, en utilisant la souris comme modèle animal. Des expériences d’immunohistochimie ont notamment permis de démontrer que les protéines DING étaient présentes dans tous les tissus testés lors de cette étude, soit le cerveau, la peau, le cœur, l’aorte, les poumons et le foie. Ceci suggère que ces protéines sont exprimées dans un grand nombre de tissus, et assurent potentiellement une fonction biologique clé. Par ailleurs, d’autres études ont confirmé chez la souris ce qui avait été préalablement observé chez Leishmania major et sur des échantillons de tissus de plantes [18], à savoir l’existence de différents isoformes de protéines DING, notamment de plus haut poids moléculaire (HMW-DING). En effet, alors que les protéines DING ont été, la plupart du temps, caractérisées comme des protéines de 38kDa, Collombet et al ., (2010) montrent l’existence d’isoformes à 52, 62, 71 et 120kDa [19]. Peu de choses sont connues sur ces différentes formes, et des investigations sont en cours. On peut néanmoins penser qu’elles puissent participer à différents processus biologiques, voire à des mécanismes de régulation. Ainsi, il a été montré qu’une forme tronquée d’une protéine DING bactérienne (PfluDING issue de Pseudomonas fluorescens ) possède une capacité à stimuler la prolifération de fibroblastes humains de façon plus intense que l’isoforme de 38kDa [20].

Il faut noter, par ailleurs, que les expériences d’immunohistochimie ont également révélé les localisations subcellulaires des protéines DING dans certains tissus de la souris. De façon intéressante, ces localisations sont spécifiques : uniquement nucléaires dans les neurones, les protéines DING sont, par exemple, présentes dans les noyaux et le cytoplasme des cellules musculaires cardiaques [19]. Ceci pourrait suggérer que les protéines DING possèdent différents rôles biologiques dans les différents tissus. Par ailleurs, la localisation nucléaire des protéines DING est cohérente avec certaines de leurs activités biologiques. Par exemple, p27sj, issue du millepertuis, inhibe la réplication du VIH et cette inhibition est médiée par des interactions physiques avec le facteur de transcription humain C/EBPβ et la protéine virale transactivatrice Tat [21]. Par ailleurs, p27sj, par son activité phosphatase, inhibe la phosphorylation du domaine C-terminal (CTD) de l’ARN polymérase II [22] et influence la réplication du VIH ainsi que la régulation du cycle cellulaire [23].

De façon intéressante, une action anti-cancéreuse a également été relatée pour l’isoforme de cette protéine (p38SJ) via la modulation du cycle cellulaire [24]. Enfin, la protéine X-DING-CD4+, décrit comme un facteur de résistance au VIH, semble interagir avec des facteurs de transcription nucléaires [9, 25]. Cette protéine est également capable de bloquer la réponse inflammatoire induit par le LPS sur les macrophages [26]. Les protéines DING présentent diverses activités (antivirale, anti-inflammatoire ou anti-cancéreuse) et semblent impliquées dans de nombreuses pathologies (arthrite rhumatoïde ou calculs rénaux).

Les structures tridimensionnelles des protéines DING

Pour l’heure, seules deux structures de protéines DING ont été résolues [27] : la structure de HPBP [6] et la structure d’un homologue bactérien, PfluDING [20, 28].

Ces deux structures sont très proches de celles des phosphate Solute Binding Proteins (phosphate-SBP) associées aux transporteurs ABC bactériens [29], bien que l’identité de séquence entre ces familles de protéines soit faible (environ 20 %). Leur repliement caractéristique, connu sous le nom de « venus fly trap », est capable de s’ouvrir ou de se fermer en présence ou en absence de ligand [30]. Cette structure est composée de deux domaines globulaires, reliés par un domaine charnière (Figure 1).

Chaque domaine est constitué d’un feuillet β central, flanqué d’hélices α et

Fig. 1. — Structure cristallographique de la Human Phosphate-Binding Protein (HPBP) (code PDB : 2v3q). Les deux domaines globulaires (en gris clair et noir) s’articulent autour d’un domaine charnière (gris foncé), et forment à leur interface une cavité qui est le site de fixation de l’ion phosphate.

contient, à la différence des phosphate-SBP, un pont disulfure. A l’interface des deux domaines, une étroite cavité constitue le site de fixation de l’ion phosphate.

Mécanisme moléculaire de fixation de l’ion phosphate

La capacité des protéines DING à fixer le phosphate a été clairement démontrée [6, 31], mais les liens entre cette capacité et les propriétés biologiques des protéines DING restent encore méconnus, même s’il semble que l’activité phosphatase de p27sj et ses conséquences sur le cycle cellulaire y sont probablement liées [23].

L’affinité pour le phosphate de PfluDING et de HPBP a été évaluée respectivement à environ 1 μM [20] et à une valeur sub-micromolaire [6], des affinités similaires à celles des phosphate-SBP bactériennes [30, 32].

Le mécanisme de fixation du phosphate a été étudié sur la protéine PfluDING, qui produit des cristaux de très grande qualité diffractant à résolution sub-atomique.

Deux structures ont ainsi pu être obtenues (0,98A Í et 0,88A Í ) à deux pH différents (4,5 et 8,5) [33]. La qualité des données obtenues a permis de positionner un grand nombre d’atomes d’hydrogène de la structure, et en particulier ceux interagissant avec l’ion phosphate. De façon surprenante, ces deux structures, obtenues à des pH très différents, montrent que la protéine fixe uniquement le phosphate dibasique, et ce, en dépit des valeurs de pK de l’ion phosphate. En effet, la protéine fixe l’ion via a 11 liaisons hydrogènes classiques et une liaison hydrogène très courte (2,50A Í ), énergétique, appelée Low Barrier Hydrogen Bond (LBHB) entre un atome d’oxygène du phosphate et le groupement carboxylate de l’Asp 62 (Figure 2). Cette liaison particulière suggère que l’atome d’hydrogène de la liaison est quasiment parfaitement partagé entre les deux atomes lourds. Cette particularité explique également la capacité de ces protéines à discriminer deux espèces chimiquement très proches comme l’ion phosphate et l’ion sulfate (avec des constantes d’affinité qui diffèrent de cinq ordres de grandeurs), car ce dernier ne possède pas de proton dans les gammes de pH physiologiques. Par ailleurs, des calculs de potentiels électrostatiques ont démontré que la cavité qui fixe le phosphate est extrêmement chargée positivement. Ce fait explique comment la protéine peut changer les pK de l’ion a phosphate, et explique ainsi l’observation de phosphate dibasique dans les deux structures, à pH 4,5 comme à pH 8,5 [33].

HPBP est un inhibiteur puissant de la réplication du VIH-1

Depuis l’introduction en 1996 de la thérapie antirétrovirale, les conditions de traitement des patients atteints par le virus VIH(-1) ont été grandement améliorées.

En revanche, cette thérapie reste perfectible, et de nouveaux problèmes surgissent, comme l’apparition de résistances pour toutes les classes d’antirétroviraux. Ainsi, il est important de considérer toutes molécules capables de lutter contre ce virus, et dans cette optique, les protéines DING sont particulièrement intéressantes. En effet, comme mentionné précédemment, certaines protéines DING, comme p27sj et la

Fig. 2. — Le réseau de liaisons hydrogène déterminé expérimentalement grâce aux structures à très haute résolution de PfluDING [33]. Les distances dans liaisons hydrogènes sont indiquées en Ångstroms. Le H entouré correspond à la Low Barrier Hydrogen Bond (LBHB).

protéine humaine X-DING-CD4+ sont capables d’inhiber le VIH-1 [9, 21]. Ces études ont suggéré que HPBP, une protéine humaine découverte dans le plasma pourrait posséder cette même propriété.

L’activité inhibitrice de HPBP a ainsi été évaluée par ajout de la protéine purifiée dans le milieu de culture de deux types cellulaires, cibles majeures du VIH-1 : les cellules primaires de type lymphocyte T CD4+ et les lignées cellulaires de type monocyte-macrophage. L’effet inhibiteur de HPBP sur la réplication du VIH-1 est très puissant, avec une IC50 dans une gamme de 5-10 nM [34] (Figure 3A), une valeur très proche de celles observées pour certaines molécules classiquement utilisées en trithérapie (6, 7-15 nM pour l’AZT et 8,5-40 nM pour le tenofivir [35]).

Par ailleurs, la cytotoxicité de HPBP reste modérée, avec des valeurs de CC50 comprises entre 140 et 200nM, l’index de sélectivité (ratio entre la dose toxique et la dose inhibitrice) étant donc de 28 à 40. Ce ratio important suggère que l’index thérapeutique de HPBP pourrait être suffisamment élevé pour initier des tests in vivo .

Par ailleurs, cette activité inhibitrice de HPBP cible spécifiquement l’étape de transcription du cycle viral ( Figure 3B ). Cette donnée est très intéressante car cette étape n’est ciblée par aucune molécule anti-VIH actuellement sur le marché. Outre la possibilité de renforcer l’arsenal thérapeutique anti-VIH déjà disponible, ceci suggère que HPBP est capable d’inhiber des souches du virus qui sont, à présent, résistantes à certaines molécules de la trithérapie. Ceci a effectivement été vérifié sur une souche VIH-1 résistante à l’AZT [34].

Fig. 3. — Inhibition de la réplication et de la transcription du virus VIH-1 par HPBP (repris de Cherrier et al ., 2011 [34]). Des cellules 1G5 ont été transfectées avec le provirus pNL4.3.

L’activité inhibitrice est mesurée suite à l’incubation des cellules en présence de la protéine HPBP purifiée. La réplication du virus est mesurée par dosage de la protéine virale p24 après 48H d’incubation. Différents contrôles sont effectués, notamment la mesure de la transcription et de la réplication basale (ligne 1), mais aussi en présence du mélange HPON1/HPBP purifié de plasma humain (lignes 2 ; 50 nM), de la paraoxonase HPON1 seule (lignes 4, 50 nM), et d’un contrôle positif d’inhibition, l’AZT (lignes 5, 10 μM). Le traitement avec 50 nM d’HPBP est présenté aux lignes 3. L’activité luciférase (A) et la réplication du virus (B) sont mesurées 48h présentées après transfection, et les valeurs présentées sont les moyennes d’au moins trois expériences indépendantes réalisées en duplicat.

La question de l’origine de cette activité et de son implication biologique reste « en suspend ». S’il semble peu vraisemblable que ces protéines DING, et en particulier HPBP, aient évolué spécifiquement pour cibler le virus du VIH, il est en revanche possible qu’elles fassent partie d’un arsenal antiviral plus général, complémentaire au système immunitaire classique. Par ailleurs, la présence d’une protéine telle que HPBP dans le plasma humain en quantité non négligeable [12], compte tenu de sa capacité inhibitrice, soulève la question de son potentiel protecteur face au virus. Le fait que HPBP soit une apolipoprotéine associée aux LDLs et VLDLs (Djeghader et al. , Plosone 2012, soumis) pourrait réduire sa biodisponibilité, et l’empêcher d’être un facteur de résistance efficace face à l’infection virale. Il est ainsi intéressant de noter qu’en présence d’un partenaire physiologique, la paraoxonase, l’activité inhibitrice de HPBP n’est plus détectée [34]. Il parait à présent essentiel de mener une étude sur des cohortes de patients malades et de patients contrôleurs du VIH afin de rechercher des corrélations éventuelles entre l’infection, la résistance et le taux de HPBP.

CONCLUSION

Les protéines DING constituent une famille de protéines qui semblent ubiquitaires chez les eucaryotes. Les gènes codant pour ces protéines sont systématiquement absents ou incomplets, y compris chez les espèces dont les génomes sont séquencés et a priori complets. Cette particularité trouve probablement sa cause dans des problèmes techniques inhérents aux méthodes de séquençage, ou est la conséquence de particularités génétiques des protéines DING non encore élucidées. Une grande partie de ces protéines sont très peu caractérisées mais sont néanmoins associées à des pathologies très importantes pour l’homme comme l’arthrite rhumatoïde, la formation de calculs rénaux, ou l’inhibition du VIH. Si les mécanismes moléculaires à la base de ces activités sont pour l’heure méconnus, certaines de ces propriétés, comme la puissante capacité inhibitrice de HPBP aussi bien pour des souches de VIH sensibles que résistantes aux traitements antirétrovirales, ouvrent de nouveaux champs d’investigations et de nouveaux espoirs de thérapie dans la lutte contre le VIH.

REMERCIEMENTS

Mikael Elias est supporté par le programme IEF Marie Curie (contrat No. 252836).

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DISCUSSION

M. Luc MONTAGNIER

Si on ne détecte pas le gène de la protéine DING, comment a-t-on pu étudier sa transcription ?

Pour les gènes des protéines DING, aucun locus ni ORF n’ont été identifiés chez les eucaryotes. Néanmoins, certaines séquences nucléiques ont pu être amplifiées mais que nous ne pouvons toujours pas les attribuer au niveau des chromosomes. Ces séquences ont permis de désigner des amorces qui ont été utilisées pour étudier la transcription des gènes des protéines DING.

M. Jean-Yves LE GALL

Comment se fait-il que partant d’une séquence peptidique complète (HPBP), il ne soit pas possible de retrouver la séquence génomique correspondante ? Envisagez-vous des hypothèses de synthèse peptidique non classiques ? Le HPBP dans le plasma est associé au complexe HDL/paraoxonase ; il s’agit donc d’une molécule hydrophobe. Comment expliquezvous qu’elle puisse également se comporter comme une molécule hydrophile ?

Il se peut que ces gènes aient des propriétés particulières qui empêchent leur séquençage.

Par exemple, il est difficile de séquencer certaines régions des chromosomes telles que l’hétérochromatine ou les régions centromériques avec les techniques actuelles. Une synthèse peptidique non classique est peu probable vu que nous avons réussi a amplifier quelques séquences partielles des gènes codant les protéines DING chez l’homme et chez plusieurs plantes. Il faut noter que les protéines DING sont une famille de protéines, et que certaines ne sont pas hydrophobes. HPBP est une protéine hydrophobe, associée avec la paraoxonase. Une fois séparé l’une de l’autre, ces deux protéines ne sont plus stables.

Mme Monique ADOLPHE

Avez-vous étudié les différences éventuelles dans le taux de protéine DING, les sidéens résistants ou sensibles au VIH ?

Les mesures de concentration des protéines DING dans une cohorte de patient « élites contrôleurs » sont en cours.

M. François-Bernard MICHEL

Après votre enthousiasme de jeunesse consécutif à la découverte des protèines DING, êtes-vous un « déçu », devant la multitude des questions sans réponse et des travaux à poursuivre ?

Même s’il est parfois décourageant en voulant fermer une porte d’en ouvrir de nouvelles, les protéines DING sont un sujet passionnant avec de nombreuses retombées. Néanmoins, on avance avec des applications concrètes comme leurs propriétés antivirales. J’ai du temps devant moi pour percer les mystères concernant les protéines DING.

 

* Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes, URMITE-UMR CNRS 7228, IRD 198, INSERM U1095, Université de la Méditerranée (Aix-Marseille II), 27 bld Jean Moulin — 13 385 Marseille, France ; e-mail : eric.chabriere@univmed.fr ** Weizmann Institute of Science, Biological Chemistry, Rehovot, Israël *** Institut de Parasitologie et Pathologie Tropicale, EA 4438, Université de Strasbourg, 3 rue Koeberlé — 67 000 Strasbourg, France **** IRBA-CRSSA, Département de Toxicologie — 38702 La Tronche Cedex, France Tirés à part : Professeur Éric Chabrière, même adresse Article reçu le 22 octobre 2011, accepté le 14 novembre 2011

Bull. Acad. Natle Méd., 2012, 196, no 3, 693-704, séance du 20 mars 2012