INTRODUCTION

Les esters organophosphorés (OP) découverts au milieu du XIXe siècle sont principalement des pesticides (parathion, malathion, chlorpyriphos, dichlorvos), certains sont des médicaments (échothiophate, métrifonate, cyclophosphamide), d’autres sont de redoutables toxiques de guerre (les agents G : tabun, sarin, soman, cylclohexyl-sarin, et les agents V : VX, VR, VC). Ces agents sont des inhibiteurs irréversibles des cholinestérases (ChE) (Fig. 1) [1]. On distingue deux types de ChE, l’acétylcholinestérase (AChE, EC 3.1.1.7) et la butyrylcholinestérase (BChE, EC 3.1.1.8). L’AChE joue un rôle majeur dans la transmission nerveuse en hydrolysant son neuromédiateur, l’acétylcholine. L’inhibition de l’AChE entraîne l’accumulation d’acétylcholine au niveau des synapses et, partant, le blocage des transmissions cholinergiques centrales et périphériques. L’intoxication aiguë par les OP se traduit par des spasmes gastro-intestinaux, une hypersalivation et une dépression des systèmes cardio-vasculaire et respiratoire qui conduit à la mort. L’atteinte du système nerveux central se manifeste par une crise convulsive épileptiforme pouvant entraîner, si elle n’est pas arrêtée rapidement, des séquelles neuropathologiques importantes (nécrose cellulaire) dans de nombreuses aires cérébrales, notamment celles impliquées dans la mémoire et l’apprentissage [2].

Des progrès significatifs ont été réalisés au cours des vingt dernières années dans le traitement d’urgence de l’intoxication par les OP et la prise en charge des personnes intoxiquées [2-5]. On admet cependant que l’approche pharmacologique classique a atteint ses limites. De plus, la persistance de certains toxiques dans l’organisme longtemps après leur pénétration complique les schémas thérapeutiques. En effet, certains OP, après absorption, sont stockés dans des sites de dépôt d’où ils sont ensuite progressivement relargués dans la circulation avant d’atteindre les synapses cholinergiques, leurs principales cibles biologiques (Fig. 2) ; le taux d’inhibition de l’AChE reste élevé pendant de longues périodes, jusqu’à plusieurs semaines, entraî- nant des complications cliniques et thérapeutiques. Ce phénomène a été décrit au cours d’intoxications sévères par le parathion [6].

Des enzymes endogènes participent aux défenses naturelles de l’organisme contre les OP. Ainsi, la présence dans le sang et les tissus d’épurateurs enzymatiques (‘‘ bioscavengers ’’) contribue à réduire la quantité d’OP atteignant les cibles biologiques. D’ailleurs, les espèces animales chez lesquelles la concentration sanguine en paraoxonase (PON1, EC 3.1.8.1) ou en carboxylestérases (CE, EC 3.1.1.1) est élevée, sont relativement résistantes aux OP [7]. Inversement, les souris knockout pour le gène de la PON1 sont très sensibles aux OP [8]. L’albumine, bien que n’étant

FIG. 1. — Mécanisme de l’inhibition des cholinestérases par les organophosphorés Après formation d’un complexe réversible entre l’enzyme et l’OP (étape 1), la sérine active (site estérasique, E-OH) de l’enzyme est phosphylée ; cette réaction s’accompagne du départ du groupement X (étape 2). L’enzyme phosphylée peut être réactivée par des agents nucléophiles, telles les oximes (Contrathion, Toxogonine, HI-6) utilisées comme antidotes dans le traitement d’urgence de l’intoxication organophosphorée (réaction 3) ; l’eau — trop faible nucléophile — ne permet pas la réactivation spontanée rapide des ChE. Lorsque la chaîne alkoxy R1 de l’OP comporte des branchements, la déalkylation de cette chaîne, catalysée par l’enzyme elle-même, conduit à un adduit non réactivable, dit ‘‘ vieilli ’’ (étape 4). Cette réaction de déalkylation peut être très rapide (t = 3 min à 37° C pour l’AChE humaine phosphonylée par le soman).

1/2 Actuellement, on ne sait ni reformer le phosphotriester ni réactiver les ChE vieillies.

pas considérée comme une enzyme, possède une activité estérasique. Cette activité est faible à l’échelle moléculaire, mais la concentration sanguine élevée de l’albumine fait que cette protéine participe à la métabolisation des carboxyl- et phosphoryl-esters dans la circulation [9].

La toxicité des OP peut être réduite en s’opposant à leur absorption au niveau de la peau et des muqueuses et/ou en abaissant leur concentration dans le compartiment sanguin afin d’empêcher leur transfert vers les synapses cholinergiques (Fig.2). Ces objectifs sont atteints en neutralisant le toxique sur les surfaces exposées et dans le sang au moyen de molécules pièges ou, mieux, de molécules catalysant leur dégradation.

PIÈGES STŒCHIOMÉTRIQUES

Les premiers pièges stœchiométriques ont été des cyclodextrines [10], des anticorps neutralisants spécifiques des OP [11] et les filtres de charbon actif. Bien que ce

FIG. 2. — Métabolisme et biodisponibilité des organophosphorés (OP) Les OP pénètrent principalement par voie transcutanée, mais aussi respiratoire (toxiques de guerre, pesticides) ou par ingestion (suicide). Les ChE sont les principales cibles biologiques (toxicité aiguë) ; l’inhibition d’autres enzymes est impliquée dans la toxicité chronique, la toxicité retardée, et dans les effets sub-létaux des OP [1, 78].

dernier procédé soit très controversé, mentionnons cependant que l’état d’un blessé de l’attentat au sarin du métro de Tokyo, résistant au traitement classique, s’amé- liora rapidement après hémodialyse [12]. Depuis une quinzaine d’années, les recherches se sont principalement orientées vers des enzymes réagissant spécifiquement avec les OP. Les carboxylestérases [13] et les cholinestérases [14] ont été proposées comme pièges stœchiométriques. Cependant, la neutralisation stœchiométrique des OP par ces enzymes exige leur administration massive avec des doses de l’ordre de 3 mg/kg [15]. Aussi, deux procédés de production industrielle de la BChE humaine ont été mis au point. Le premier consiste à purifier l’enzyme naturelle à partir du plasma (fraction IV de Cohn). Ce procédé est développé par la société américaine Baxter (www.baxter.com). On estime que jusqu’à 100 000 doses de 200 mg par an pourraient être produites aux Etats-Unis. Ce stock serait cependant insuffisant en cas de conflit ou d’attaque terroriste majeure. Aussi, une seconde voie a été proposée par la société canadienne Nexia (www.nexiabiotech.com) : l’expression de la BChE humaine (ProtexiaTM) dans le lait de chèvres transgéniques. Depuis 2005 le développement et la formulation (PEGylation) de cette enzyme recombinante sont
poursuivis aux Etats-Unis par la société Pharmathene (www.pharmathene.com).

Un litre de lait fournit jusqu’à plusieurs grammes d’enzyme. Ainsi, un cheptel de 100 chèvres transgéniques peut produire 1 million de doses par an pour un coût 5 fois moindre (100$/dose) que la BChE purifiée à partir du plasma. En 2006, la Food and Drug Administration (FDA) a décerné à la BCHE humaine le statut d’« Investigational New Drug » (IND) [16]. Les essais cliniques sur volontaires sains (Phase 1) ont débuté en octobre 2006. La BChE pourrait entrer en dotation dans l’armée américaine dès 2008 PIÈGES CATALYTIQUES

Parallèlement aux études sur les pièges stœchiométriques, épurateurs de première génération, des programmes de recherche sur les enzymes catalysant la dégradation des OP ont été initialisés. Ces enzymes détoxifient les OP par hydrolyse du phosphoester ou diminuent leur toxicité par dégradation de leurs chaînes alkyles/aryles.

Le concept d’épurateur catalytique, épurateur de seconde génération, repose sur l’idée de piéger et de dégrader les OP dans la circulation sanguine avant qu’ils n’atteignent les cibles neurologiques et musculaires. Ainsi, l’administration (par voie injectable) préventive d’enzymes hydrolysant rapidement les OP, en association avec les moyens prophylactiques existants (pyridostigmine), permettrait aux personnels médicaux d’intervenir en toute sécurité sur des blessés chimiques et aux équipes spécialisées (démineurs, pompiers) d’opérer en milieu contaminé. L’administration de ces enzymes à des personnes intoxiquées par des OP et déjà médicalisées, pourrait améliorer considérablement l’efficacité des contre-mesures pharmacologiques mises en œuvre [17]. Dans cette perspective, les critères symptomatologiques déterminant le triage et la prise en charge des blessés chimiques sur un théâtre d’opération ou sur le lieu d’un attentat pourraient être reconsidérés.

L’utilisation de ces enzymes est également envisagée pour la protection et la décontamination de la peau des muqueuses et des blessures ouvertes [18, 19]. Enfin, des bactéries génétiquement modifiées, produisant ces enzymes, introduites dans le circuit des effluents des douches de décontamination des blessés, pourront épurer les eaux contaminées avant leur recyclage ou leur rejet dans l’environnement [20]. Bien que les recherches sur les anticorps catalytiques [21] et les β-cyclodextrines fonctionnalisées [22] aient progressé, l’ingénierie des enzymes dégradant les OP est le champ de recherche le plus prometteur à court terme.

CONDITIONS POUR UNE EFFICACITÉ OPTIMALE

Les conditions requises pour l’utilisation d’enzymes dégradant les OP comme contre-mesure médicale de l’intoxication organophosphorée restent un défi biotechnologique que les progrès du génie enzymatique permettent de relever.

Les conditions générales sont les suivantes : ces enzymes doivent avoir un large spectre d’activité ; leur production doit être possible à grande échelle et à un coût raisonnable ; enfin, leur conservation sur de longues durées sans perte d’activité (en solution, lyophilisées ou fixées sur support) doit être assurée dans des conditions acceptables. L’optimisation de la stabilité conformationnelle de ces enzymes peut être réalisée par modification chimique ou par adjonction de composés stabilisateurs tels que des sucres ou des polyols. Les enzymes thermostables issues de bactéries thermophiles [23] ou d’organismes mésophiles dont la stabilité est augmentée par mutagenèse ou évolution dirigée (Elias et al. , non publié) constituent une alternative prometteuse.

D’autres conditions sont liées au mode d’utilisation de ces enzymes. Dans le cas d’une administration parentérale, la concentration sanguine du toxique est un paramètre important à considérer. Cette concentration, [OP], est toujours très faible, même dans les cas d’intoxication graves. Par exemple, la concentration en sarin dans le sérum de victimes des attentats de Matsumoto et de Tokyo a été estimée comprise entre 1,5 et 30 nM 14 heures après l’exposition au toxique et avant que ne débute le traitement [24]. La concentration en OP, toujours très inférieure au K de m l’enzyme pour ce substrat, impose une cinétique de dégradation du toxique dans le sang d’ordre 1 [25], soit :

v = k /

K .[E].[OP] (1) cat m Dans l’Eq. 1, le produit de la constante bimoléculaire k /

K par la concentration cat m en sites actifs de l’enzyme [E] représente la constante de vitesse de premier ordre. La dégradation du toxique en un temps court nécessite donc l’injection d’une dose importante d’enzyme. Cependant, la dose à administrer pourra être fortement réduite si l’efficacité catalytique, k / K , de l’enzyme est très élevée. Par mutagenèse cat m ou par évolution dirigée, il est possible d’augmenter la valeur de cette constante d’efficacité de plusieurs ordres de grandeur.

La seconde contrainte est de maintenir élevée, le plus longtemps possible, la concentration de l’enzyme [E] dans le sang. Celle-ci est fonction de sa pharmacocinétique et/ou de la fréquence des injections répétées. La diminution de la microhétérogénéité des chaînes glycaniques, la polymérisation des enzymes, et des modifications chimiques de surface (‘‘ caping ’’) permettent d’accroître les temps de transit (ou les demi-vies biologiques) des enzymes injectées [26]. La rapidité de la clairance des glycoprotéines est souvent due à des défauts de glycosylation, lesquels peuvent être corrigés par voie chimique ou — dans le cas des enzymes recombinantes — par manipulation du système d’expression [27]. Enfin, l’immunotolérance des enzymes injectées doit être assurée ; la conjugaison à des dérivés du dextran ou du polyéthylène glycol (PEGylation) peut être suffisante pour réduire l’antigénicité tout en diminuant la clairance.

Plutôt que le recours à l’injection d’enzymes pour la décontamination interne, l’épuration du sang est théoriquement réalisable au moyen de dispositifs de dialyse extracorporelle sur lesquels les enzymes sont greffées [28]. Dans ce cas, k / K doit cat m
être aussi élevée que possible. De plus, l’accessibilité de l’OP au site actif de l’enzyme ne doit pas être altérée par le procédé d’immobilisation ou par l’interaction avec la matrice. La concentration en sites actifs par unité de surface doit être maximale et le débit sanguin doit être optimisé pour diminuer les contraintes diffusionnelles. La cinétique de dégradation d’ordre 1 s’applique donc dans les conditions particulières d’enzymes immobilisées dans un réacteur à flux continu. Les problèmes d’immunocompatibilité théoriquement supprimés permettent dès lors d’utiliser des enzyme non-humaines. Enfin, la production d’enzymes in situ , à la demande et de façon transitoire, sera possible par les méthodes de la thérapie génique. Des résultats très prometteurs ont été récemment publiés pour la paraoxonase humaine [29, 30] et pour l’AChE humaine [31].

Les enzymes incorporées dans des lotions et des collyres, immobilisées dans des mousses ou sur des lingettes pour la décontamination de la peau ou de l’œil [32], ou encore dans des crèmes topiques cutanées protectrices [33], agissent dans des conditions où la concentration locale en OP peut être très élevée. L’ordre de la réaction par rapport à la concentration [OP] tend dans ce cas vers zéro, de telle sorte que la vitesse réactionnelle approche la vitesse maximale :

v→V = k .[E] (2) max cat L’efficacité dépend à la fois de la concentration en enzyme et de sa constante catalytique k . Pour un usage externe, il importe donc de disposer de préparations cat enzymatiques très concentrées ayant une activité catalytique moléculaire très élevée.

La co-immobilisation de différents types d’enzymes, en élargissant le spectre des substances dégradables, permettrait de détoxifier simultanément les composés G et V ainsi que d’autres agents dans l’éventualité de l’exposition à une combinaison de toxiques. Un tel cas de figure doit être considéré. En effet, lors du conflit entre l’Iran et l’Irak, le tabun et d’autres OP ont été associés à l’ypérite dans certaines attaques chimiques [34]. Dans le cas de conflits asymétriques et de terrorisme eschatologique ou de type mafieux, les scenarii les plus extrêmes sont à prendre en compte.

ENZYMES POTENTIELLES

Les projets d’ingénierie enzymatique que nous développons portent sur les cholinestérases et les phosphotriestérases.

Cholinestérases

Selon la figure 1, les OP peuvent être considérés comme des pseudo-substrats des ChEs. En effet, lorsque ces enzymes réagissent avec de vrais substrats, l’acyl-enzyme formée lors de l’étape 2 n’a qu’une existence transitoire, le groupement acyl étant rapidement déplacé par une molécule d’eau (étape 3). Au contraire, avec les OP,
l’hydrolyse de l’intermédiaire phosphyl-enzyme est très lente, voire impossible, et l’enzyme reste inhibée. La stéréochimie tétraédrique du groupement phosphyl conjugué à la sérine restreint l’accessibilité de l’eau à l’atome de phosphore [35] ; le groupement phosphyl ne peut donc être déplacé. Cependant, il a été postulé que l’introduction d’un second centre nucléophile dans le centre actif devrait activer une molécule d’eau qui, en attaquant l’atome de phosphore sur la face opposée à la liaison P-sérine, convertirait les ChE en OP hydrolases (OPH). Cette hypothèse fut vérifiée à l’institut de défense médicale contre l’arme chimique de l’Armée américaine (USAMRICD, Aberdeen, Maryland) peu après la résolution de la première structure tridimensionnelle d’une AChE [36]. La BChE humaine fut choisie comme enzyme modèle car son centre actif est plus spacieux et moins stéréosélectif que celui de l’AChE. Des mutants furent conçus par modélisation moléculaire. Le second pôle nucléophile fut créé dans le trou oxyanion du centre actif en remplaçant une glycine par une histidine. Le mutant G117H ainsi conçu est capable d’hydrolyser le paraoxon, le sarin, l’échothiophate et le VX [37, 38]. Cependant, ce mutant est irréversiblement inhibé par le soman à cause du ‘‘ vieillissement ’’ (‘‘ aging ’’) du conjugué (Fig. 1, réaction 4) plus rapide que la réaction de déphosphonylation. Le mécanisme du ‘‘ vieillissement ’’ des ChEs, en partie élucidé, implique le passage par un état de transition carbocationique stabilisé par les résidus E197 et W82 du centre actif ainsi que par des molécules d’eau [39-41]. Le remplacement du glutamate 197 par un aspartate, une glutamine ou une glycine a pour effet de réduire considérablement la vitesse de cette réaction. Comme attendu, le double mutant G117H/E197Q hydrolyse le soman [42]. Cependant, l’activité OPH de ces deux mutants est trop faible pour qu’ils présentent un intérêt thérapeutique.

La découverte d’une mouche à viande ( Lucilia cuprina ) résistante aux OP grâce à une carboxylestérase (CE) possédant la mutation G137D, une position homologue à G117, incita la poursuite des recherches sur les mutants des ChE. Cette mutation confère à la CE une activité OPH faible compensée par l’abondance de l’enzyme dans les organes de l’insecte [43]. Ainsi, ces dix dernières années, plus de 50 mutants de BChE humaine possédant de multiples mutations en plus de la mutation G117H furent créés [44]. En parallèle, des mutants d’AChE humaine et de bungare ( Bungarus fasciatus ) furent conçus sur le même principe [45]. Malheureusement, aucune de ces mutéines ne se révéla plus active que le mutant G117H. Il semblait donc vain de vouloir changer la spécificité des ChE par mutagenèse dirigée. Cependant, grâce à la connaissance de structure tridimensionnelle de la BChE humaine [46] et à la simulation par dynamique moléculaire de l’état de transition d’acylation, un mutant très actif vis-à-vis de la (-)-cocaïne a pu être créé [47]. La possibilité de simuler les états de transition catalytiques ouvre donc la voie à la conception de mutants optimisant les interactions favorables au franchissement de la barrière énergétique de l’acte catalytique. Cette nouvelle stratégie de mutagenèse dirigée, dite ‘‘ intelligente ’’, et la mise en œuvre, en parallèle, d’un programme d’évolution dirigée de la BChE humaine a donc de grandes chances d’aboutir à la création de mutéines opérationnelles.

Certains mutants des ChE sensibles aux OP mais ne ‘‘ vieillissant ’’ pas après phosphylation, sont totalement réactivables (cf. Fig.1, réaction 3) [42-44]. Associés à des réactivateurs (pralidoxime (Contrathion) ou HI-6), ils sont capables d’hydrolyser rapidement les OP. Ces systèmes enzymatiques constituent une famille d’épurateurs pseudo-catalytiques potentiellement très efficaces [48].

La bio-disponibilité des ChE mutées, destinées à être injectées est un autre problème à maîtriser. L’étude de la pharmacocinétique de la BChE humaine naturelle injectée au rat a montré que la demi-vie biologique (t ) de l’enzyme dans la circulation 1/2 dépend de sa sialylation [49]. Des études réalisées avec d’autres ChE naturelles ou recombinantes l’ont confirmé [50, 51], précisant que t est inversement proportion1/2 nel au nombre de sites d’attachement d’acide sialique (acide N-acétylneuraminique) vacants [50]. On sait que l’élimination rapide des asialoglycoprotéines de la circulation résulte de leur capture par des récepteurs situés en surface des hépatocytes. Ces récepteurs sont spécifiques du galactose, le sucre précédant l’acide sialique dans la séquence des chaînes glycaniques des sialoglycoprotéines. Pour augmenter le t des 1/2 sialoglycoprotéines recombinantes, il importe donc que tous les sites d’attachement de l’acide sialique sur les chaînes glycaniques soit occupés afin de masquer les résidus galactosyles. Cet objectif peut être réalisé soit en introduisant des inhibiteurs de la neuraminidase dans le milieu de culture cellulaire, soit en sialylant in vitro la protéine recombinante purifiée sous l’action d’une sialyltransférase, ou encore en utilisant un système d’expression capable de synthétiser des chaînes glycanes identiques à celles de l’enzyme naturelle. Une solution élégante a été proposée pour l’AChE humaine recombinante ; l’enzyme est produite dans des cellules HEK 293 surexprimant la sialyltransférase. Dans ces conditions, la sialylation de l’enzyme est complète [52].

Phosphotriestérases

Les phosphotriestérases bactériennes — La PTE de Pseudomonas diminuta est une métallo-enzyme dimérique de 72 kDa utilisant le zinc comme cofacteur. Sa structure 3D a été déterminée [53], mais son mécanisme d’action, ainsi que le rôle fonctionnel des aminoacides de son centre actif sont encore mal connus. Son efficacité catalytique vis-à-vis du paraoxon est proche de la limite physique de diffusion ; elle est moins active contre les toxiques de guerre (Tableau). Il a cependant été possible d’augmenter son efficacité par évolution dirigée [54]. Trois cycles de mutation ont été suffisants pour que l’efficacité d’un mutant de PTE vis-à-vis d’un analogue du soman soit augmentée d’un facteur 1000 par rapport à l’enzyme sauvage. De nombreux travaux ont démontré l’intérêt de cette enzyme pour la décontamination ou la protection cutanée [18, 19, 55]. Des études ont aussi montré que l’administration de PTE avant ou après exposition aux OPs améliore le prétraitement ou le traitement classique de l’intoxication OP [16]. Cependant, pour éviter les problèmes pharmacocinétiques et/ou immunologiques consécutifs à l’injection d’une enzyme bactérienne, celle-ci peut être PEGylée (Jun et al. , en préparation). L’encapsulation dans des liposomes a également été proposée, les premiers essais sont prometteurs

TABLEAU. — Efficacité catalytique (k /K ; M-1.min-1) des phosphotriestérases : PON1 humaine, cat m DFPase de Loligo vulgaris et PTE de Pseudomonas diminuta

OP PON1 DFPase [81] Zn2+ – PTE

A (Q191) B (R191) Paraoxon 6.8 x105 2.4 x106 [79] 2.0 × 109 [82] DF 3.7 x104 ND [25] 7.8 × 107 5.8 × 108 [83] Sarin 9.1 x105 6.8 x104 [80] 2.4 × 106 4.8 × 106 [84] Soman 2.8 x106 2.1 x106 [80] 2.4 × 106 6.0 × 105 [84] VX oui *

0 0.04 × 106 [85] * Broomfield, C.A., résultat non publié ; ND, non déterminé [56]. Alternativement, le sang pourrait être épuré par passage dans un réacteur à enzyme immobilisée sur fibres creuses (résultats non publiés) grâce à un système de circulation extracorporelle.

La paraoxonase humaine (PON1) — Cette enzyme plasmatique calciumdépendante de 44 kDa est transportée par les HDL associée à différentes apolipoprotéines. Les deux allélozymes (Q192 et R192) connus présentent des proprié- tés catalytiques légèrement différentes vis-à-vis des OP (Tableau I) et des arylesters [57]. La PON1 est également pourvue de propriétés anti-athérogéniques [8,58].

Même si son activité physiologique est vraisemblablement celle d’une lactonase lipophile [59], d’autres activités attribuées à cette enzyme polyvalente sont encore débattues. La structure 3D de la PON1 humaine n’a pas encore été déterminée, sa séquence ne présente aucune similarité avec les protéines connues et, jusqu’à une date récente, on avait peu d’informations sur les caractéristiques de son centre actif.

Des travaux de mutagenèse dirigée et de modifications chimiques ont permis de déterminer les éléments essentiels du centre actif de la PON1 [60]. La modélisation moléculaire [61, 62] et la structure cristallographique d’une PON chimère [63] montrent que son repliement est analogue à celui de la DFPase de calmar ( Loligo vulgaris ) [64]. Le mécanisme de cette phosphotriestérase calcium-dépendante vient d’être décrit [65]. S’il se confirme que la PON1 fonctionne de façon similaire, cette donnée fournira une aide considérable au développement de mutants de PON1 plus actifs.

Les études sur le pouvoir détoxifiant de la PON1 désignent cette enzyme comme l’un des épurateurs catalytiques les plus prometteurs [66, 67]. Aussi, l’amélioration de ses propriétés catalytiques et sa fonctionnalisation sont l’objet de recherches très actives. Pour être utilisable dans des protocoles de protection, décontamination, ou traitement des agressions par les OP, l’efficacité catalytique de la PON1 devrait être 100 fois plus élevée vis-à-vis de ces toxiques. Les propriétés de mutéines de PON1 chimérique obtenues par évolution dirigée indiquent que cet objectif sera bientôt atteint [68]. Cependant, l’instabilité de la PON1 risque d’être un frein à son développement biotechnologique. En effet, cette enzyme, physiologiquement liée aux

HDL, a besoin d’être associée à des apo-lipoprotéines partenaires pour garder sa conformation active et stable [69, 70]. Une lipoprotéine transporteuse du phosphate minéral dans le sang, la HPBP, a été récemment découverte et sa structure 3D a été résolue [71]. La HPBP, difficilement séparable de la PON1 in vitro [72], apparaît participer à ce rôle de chaperon fonctionnel. Nous envisageons de co-exprimer les deux protéines humaines dans E. coli afin de favoriser le repliement correct de la rPON1 humaine, de stabiliser sa conformation fonctionnelle et permettre la cristallisation du complexe rPON1/rHPBP. La structure du cristal conduira alors à la résolution de la structure 3D de la PON1 humaine, étape essentielle pour la conception d’épurateurs catalytiques opérationnels basés sur cette enzyme.

L’utilisation de gènes de PON1 optimisée est enfin envisagée pour des applications de thérapie génique. Plusieurs approches avec différents systèmes de transfection ont montré chez la souris une amélioration notable de la protection vis-à-vis des OP, ainsi qu’une réduction des signes d’athérosclérose [29,30,73]. Ces résultats suggèrent que la surexpression de la PON1 bénéficie aux différentes fonctions de l’enzyme, mais nous alertent quant aux possibles effets iatrogènes d’enzymes aux fonctions physiologiques mal identifiées administrées ou produites en concentrations importantes dans l’organisme.

Autres enzymes

Il existe d’autres enzymes dégradant les OP, les prolidases (EC 3.4.13.9) et les glutathion-S-transférases. (GST, EC 2.5.1.18). Les premières ont été isolées de bactéries halophiles modérées ( A. haloplanktis et A. sp. JD6.5). La prolidase d’ A. sp.

JD6.5 est l’enzyme la plus active que l’on connaisse actuellement pour dégrader le soman ( k = 3100 s-1), mais elle n’a aucune action sur le VX [74]. Ces enzymes sont cat particulièrement intéressantes pour la destruction des stocks de munitions chimiques, la remédiation des sols, et la décontamination des matériels, des tenues de protection et de l’eau polluée par les pesticides et les toxiques de guerre [75]. Les glutathion-S-transférases participent à la détoxication des OP en métabolisant leurs chaînes alkyl/aryles. Ce sont des enzymes de 20 à 30 kDa qui catalysent la conjugaison du glutathion (attaque nucléophile de l’atome de soufre) avec des substrats électrophiles. Elles jouent un rôle fondamental dans les processus de détoxication cellulaire de substances endogènes et de nombreux xénobiotiques. Elles participent à la résistance des insectes vis-à-vis des insecticides. La détoxication des OP par les GST résulte d’une déalkylation régiosélective d’une chaîne latérale alkyle ou aryle [76]. Ces enzymes présentent un polymorphisme génétique très large. Certaines allélozymes de la GST de drosophile ( D. melanogaste r) et de mouche ( Musca domestica ) très actives vis-à-vis des insecticides OP ont été clonées et exprimées dans

E. coli [77].

CONCLUSION

Les enzymes neutralisant et/ou dégradant les OP peuvent être purifiées à partir de sources naturelles (plasma humain) ou produites par génie génétique dans des systèmes d’expression procaryotes ( E. coli ), eucaryotes (levures, cellules d’insecte, cellules de mammifère), dans des animaux et des plantes transgéniques (chèvre, lapine, tabac, tomate, pomme de terre), voire dans des systèmes de synthèse acellulaire. Les recherches actuelles visent à améliorer les différents systèmes d’expression afin de produire les mutéines recombinantes en grande quantité et à des coûts raisonnables. En ce qui concerne les OP hydrolases, les recherches visent surtout à améliorer leurs propriétés catalytiques in vitro et in vivo vis-à-vis des neurotoxiques de guerre, accroître leur stabilité opérationnelle (stabilité in vivo ) et conformationnelle (stabilité au stockage sous forme lyophilisée ou en solution), assurer leur tolérance immunitaire et une bonne bio-disponibilité. Les différentes stratégies de l’ingénierie protéique sont mises en œuvre : recherche d’enzymes naturelles, en particulier dans des biotopes extrêmes (bactéries halophiles, thermophiles et piézophiles) et chez les insectes résistants aux OP ; modélisation moléculaire ; mutagenèse dirigée « intelligente » et évolution dirigée ; manipulation des systèmes d’expression ; modifications physiques et chimiques des enzymes sélectionnées. Les études pharmacocinétiques, immunologiques et toxicologiques (essais de protection sur des modèles animaux intoxiqués par différents types d’OP) ont déjà validé plusieurs enzymes d’intérêt.

L’introduction des épurateurs catalytiques dans l’arsenal des contre-mesures médicales destinées à protéger et à traiter l’homme soumis aux agressions par les organophosphorés est pour demain. La thérapie génique offrira quant à elle, à plus long terme, la possibilité de produire dans l’organisme de façon transitoire et selon les besoins, des enzymes humaines dégradant ces toxiques.

REMERCIEMENTS

Nos recherches bénéficient du soutien de la Direction Centrale du Service de Santé des Armées et de la Délégation Générale pour l’Armement (PEA/DGA 01807, projet 03co010-05) et de l’Armée allemande (contrat M/SAB1/3/A010 à D.R.).

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DISCUSSION

M. Roger BOULU

Cherche-t-on des bio-épurateurs traversant la barrière hémato-encéphalique ?

Non, le concept de bio-épurateur repose essentiellement sur la création d’une barrière enzymatique circulante piégeant et inactivant les toxiques avant qu’ils n’atteignent leurs cibles neuronales. Ces enzymes administrées par voie parentérale doivent demeurer le plus longtemps possible dans la circulation en concentration élevée.

M. Jean-Yves LE GALL

Quelle est la durée de vie de la butyrylcholinestérase injectée par voie IM ou IV ?

La demi-vie biologique de la butyrylcholinesterase humaine injectée en iv chez l’homme est de dix à douze jours. Le temps de résidence moyen de l’enzyme naturelle humaine injectée chez le singe rhesus est d’environ quatre vingt treize heures. Pour l’enzyme injectée en iv, le Tm est atteint en une minute et en dix heures après injection im. En ce qui concerne l’injection chez le singe rhesus de l’enzyme recombinante produite dans le lait de chèvre transgénique, le temps de résidence est environ dix fois plus court que celui de l’enzyme naturelle. Cependant, le temps de résidence moyen de l’enzyme recombinante PEGylée et son profil pharmacocinétique sont similaires à ceux de l’enzyme naturelle.

Les résultats des essais cliniques de phase 1 sur volontaires ne sont pas encore connus.

Bull. Acad. Natle Méd., 2007, 191, no 1, 93-112, séance du 30 janvier 2007