Communication scientifique
Séance du 16 février 2010

Apport de l’expérimentation animale dans l’étude de la reproduction, de la procréation médicale assistée et du développement

MOTS-CLÉS : développement embryonnaire.. technique de reproduction assistée
Contribution of animal models to the study of reproduction, assisted reproductive technologies and of development
KEY-WORDS : embryonic development. models, animal. reproductive techniques, assisted

Hélène Jammes, Patricia Fauque et Pierre Jouannet

Résumé

Les enfants nés par procréation médicale assistée (PMA) constituent une part importante des naissances (environ 2,4 % en France). Une attention toute particulière a été accordée à l’impact de ces techniques sur la santé des enfants. Dans leur grande majorité, les enfants conçus par PMA sont en bonne santé, bien qu’on puisse observer une augmentation du risque de perturbations mineures à la naissance, un petit poids de naissance et dans de rares cas des syndromes de l’empreinte parentale tels que les syndromes de Beckwith-Wiedemann (SBW), d’Angelman (SA) et de Silver Russel (SRS). L’utilisation de modèles animaux est indéniablement pertinente pour rechercher les effets possibles de chacune des procédures liées à la PMA (stimulation ovarienne, manipulations des gamètes, fécondation in vitro , culture et transfert d’embryons) sur la reprogrammation épigénétique. Cette revue présente des études menées dans un contexte liant épigénétique et défauts de développement en appliquant les techniques de la PMA dans des modèles animaux. Les résultats obtenus soulignent la nécessité de poursuivre les efforts focalisés sur les perturbations épigénétiques induites par la PMA, non seulement liées à l’empreinte parentale mais aussi concernant d’autres loci dans la perspective de mieux appréhender les effets à long terme de ces technologies sur la santé.

Summary

Children conceived through assisted reproductive technologies (ART) now account for a noteworthy proportion ( ∼ 2.4 %) of births in France. Considerable attention is being paid to the outcome of ART pregnancies. The vast majority of these children are apparently normal. However, they are at an increased risk of minor birth defects, low birth weight, and rare imprinting disorders such as Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS), Angelman syndrome (AS) and Silver Russel syndrome (SRS). Animal models are important for investigating the possible role of each step of ART (ovarian stimulation, gamete manipulation, in vitro fertilization, embryo culture and embryo transfer) in epigenetic reprogramming. This review discusses these issues in the context of epigenetic and developmental abnormalities observed in animals following ART. More research is needed on ART — induced errors, focusing not only on genomic imprinting but also on non-imprinted loci, which may help explain some of the more subtle longer-term health effects emerging from studies with animal models.

La naissance de Louise Brown obtenue par Fécondation in vitro (FIV) en 1978 est survenue après quelques essais fructueux de FIV chez des animaux de laboratoire [1]. Elle a été suivie par celle de millions d’enfants conçus par les techniques de FIV avec ou sans microinjection (ICSI). En France, 20 657 enfants sont nés des différentes techniques d’Assistance Médicale à la Procréation (PMA) réalisées en 2007 (www.agence-biomedecine.fr) ce qui représente 2,4 % des naissances. Depuis la généralisation de la FIV et de l’ICSI, la question des conséquences de ces techniques sur le développement fœtal et sur la santé des enfants a été posée. Plusieurs études épidémiologiques et cliniques ont été conduites pour évaluer les risques potentiels.

Les enfants ont un petit poids de naissance non seulement après une grossesse multiple mais aussi après une grossesse unique [2-4]. Plusieurs études rapportent une augmentation de l’incidence des malformations congénitales [5-7], des aneuploïdies chromosomiques [8], des troubles de la croissance et du métabolisme avec d’éventuelles conséquences cardio-vasculaires [9-11] ainsi que des retards de développement psychomoteur ou mental chez l’enfant [12]. Cependant, ces résultats n’ont pas toujours été confirmés [13] et ont été parfois contestés pour plusieurs raisons : les nombreux perdus de vue, les méthodes de suivi non standardisées, le manque de groupe contrôle, etc.[14]. Il semble cependant difficile d’écarter complètement un certain risque lié aux méthodes de PMA indépendamment des complications les plus fréquentes dues aux grossesses multiples. Des perturbations de la fonction thyroïdienne qui pourraient avoir des causes épigénétiques ont été signalées chez les enfants issus de FIV [15]. Mais surtout, parmi les complications observées chez les enfants nés après PMA, figure le risque de développer des syndromes tels que les syndromes de Beckwith-Wiedemann (BWS ; [16-19], de Prader Willi (PWS) — Angelman (AS ; [20-22]) et de Silver-Russell (SRS ; [23-25]), liés à des gènes dits soumis à l’empreinte parentale et dont l’expression dépend aussi de régulations épigénétiques (voir l’article d’Yves Le Bouc ci-joint).

La FIV et l’ICSI mettent en jeu différentes procédures incluant la collecte et éventuellement la maturation in vitro des ovocytes après stimulation ovarienne chez la femme, la sélection des spermatozoïdes, la fécondation, la culture des embryons dans différents milieux, le transfert dans l’utérus des embryons à différents stades de développement, éventuellement la congélation des embryons…..Évaluer l’impact de

Fig. 1. — Au sein du noyau, la double hélice d’ADN s’enroule autour d’octamères d’histones formant un nucléosome. Ce « collier de perle » s’enroule à son tour en chromatine qui constitue le chromosome. Les histones portent sur leurs extrémités N et C terminales des modifications post traductionnelles (acétylation, méthylation, phosphorylation et ubiquinilation). La méthylation de l’ADN intervient de manière symétrique (sur les deux brins d’ADN) de par la greffe de groupe methyl (CH3) sur les cytosines engagées dans des dinucléotides CpG. Les combinaisons de ces différentes marques épigénétiques aboutissent à une architecture chromatinienne définissant des domaines accessibles aux facteurs de transcription et donc actifs en terme d’expression de gènes et des domaines condensés, fermés où la transcription est réprimée.

chacune de ces étapes et leurs conséquences possibles à plus ou moins long terme est une grande préoccupation et requiert l’utilisation de modèle animaux. Au cours de ces dernières années, de nombreuses expérimentations se sont focalisées sur le statut épigénétique des embryons issus de telles manipulations.

Epigénétique, développement embryonnaire et empreinte parentale

Historiquement, le terme d’

Epigénétique , créé par la contraction des mots « épigé- nèse » et « génétique » a été utilisé en première intention en 1942 par Conrad Waddington (1905-1975 [26]), qui propose alors l’idée selon laquelle « le développement et l’évolution peuvent être considérés comme une succession d’états relativement stables séparés par des périodes d’instabilité et de changements » et définit « l ’épigénétique comme la branche de la biologie qui étudie les interactions causales entre les gènes et leurs produits, responsables de l’existence du phénotype ». Ce néologisme a changé progressivement de sens et désigne dorénavant non plus l’étude de la fonction des gènes dans le développement, mais plutôt celle des changements héritables de l’activité génique sans changement de la séquence des nucléotides [27].

Au cours du développement et de la différenciation cellulaire, des processus molé- culaires tendant à modifier l’architecture de la chromatine vont présider à la sélection de l’information génétique et aboutir à des patrons d’expression de gènes tissu-spécifiques.

Plus simplement, deux cellules d’un même individu, par exemple un hépatocyte et un neurone, ne traitent pas l’information génétique qu’elles portent de la même façon ; des processus moléculaires héritables confèrent à chacune d’elles une identité épigénétique . Ces processus comprennent la méthylation des cytosines de l’ADN (méthylation en position 5’ des cytosines des dinucléotides CpG), des modifications post traductionnelles des histones (protéines au cœur des nucléosomes structurant la chromatine ; « code des histones », acétylation, méthylation, phosphorylation…), des ARN non codants, des protéines de la famille Polycomb/Thritorax. Les interactions entre ces différents partenaires aboutissent à la création de domaines chromatiniens aux capacités de transcription différentes (domaine de répression ou d’activation des gènes), pilotant ainsi l’expression génique responsable de l’identité cellulaire (Figure 1).

Le développement embryonnaire dès la fécondation, est le siège de modifications épigénétiques majeures [28]. Les différences dans la programmation de l’expression des gènes, abordées maintenant par les analyses de transcriptomique à haut débit, sont à la base de la différenciation cellulaire, tissulaire et de l’organogénèse et sont orchestrées par des régulations épigénétiques. Au cours de la différenciation et du développement, les cellules accumulent des marques épigénétiques qui diffèrent de celles des cellules pluripotentes et les orientent vers des lignages différents.

Les premières étapes de la vie sont marquées par des modifications majeures des patrimoines épigénétiques maternel et paternel afin de favoriser très rapidement l’expression des gènes responsables du programme de développement embryonnaire.

Cette étape d’activation du génome embryonnaire nouvellement formé, est cruciale.

Il se produit à la fois une déméthylation des génomes (paternel et maternel), active ou passive, complète ou partielle (différente selon l’espèce considérée), une méthylation de l’histone H3 sur les résidus lysine 27 et 9 associée à une répression transcriptionnelle et l’intervention des protéines Polycomb. L’ensemble de ces phénomènes contribue ainsi à des processus de remodelage de la chromatine et de répression/activation des gènes. L’évolution de ces modifications que l’on appelle aussi « marques épigéné- tiques » est représentative de la flexibilité de ces processus concernant la prise de décision qui va aboutir à l’identité ultérieure des cellules. Par exemple, chez la souris, dès le stade 4 cellules, de récentes études suggèrent qu’une asymétrie épigénétique cellulaire pourrait intervenir avant toute modification transcriptionnelle impliquée dans le passage de la totipotence à la pluripotence de certains blastomères [29]. La mise en place de deux premiers lignages cellulaires, à savoir le trophectoderme et la masse cellulaire interne dépend donc de patrons d’expression de gènes dont le contrôle est assuré par des changements épigénétiques majeurs maintenant bien connus chez la souris (figure 2).

 

Au cours de cette phase préimplantatoire, l’embryon présente une certaine forme d’autonomie, basée sur l’utilisation des produits du cytoplasme ovocytaire (protéï- nes et ARNm maternels…) et sur la mise en route du génome embryonnaire. Il est tout à fait raisonnable de penser que la vitesse de clivage des cellules embryonnaires et que les fenêtres temporelles pendant lesquelles les processus génomiques se déroulent pourraient dépendre de l’impact des facteurs environnementaux. Les différences subtiles qui se manifestent entre espèces doivent être documentées afin de mieux appréhender ces processus et leurs éventuelles perturbations (Figure 4).

Ainsi chez la souris, la dégradation de tous les transcrits maternels est à 90 % complète au stade 2 cellules. L’activation du génome embryonnaire (EGA pour « Embryonnic Genome Activation ») s’effectue en une première vague « mineure » dès le stade 1 cellule suivie d’une deuxième vague « majeure » entre les stades 2 et 4 cellules [26]. Ceci permet la transcription des gènes embryonnaires indispensables à la poursuite du développement. La transcription des gènes impliqués dans la polarité et dans la compaction des blastomères, appelée MGA pour « Midpreimplantation Gene Activation », se met ensuite en place. Au contraire chez la plupart des mammifères [27, 28], incluant l’espèce humaine [29], l’activation transcriptionnelle du génome embryonnaire débute plus tard. Ainsi, l’embryon se développe en utilisant les réserves de facteurs maternels pendant une période plus longue et l’activation du génome embryonnaire est concomitante aux premiers évènements de différenciation cellulaire. L’étape primordiale suivante est la différenciation des premières lignages cellulaires avec la formation du blastocèle puis du blastocyste qui elle aussi se met en place avec un timing espèce-dépendant. Ces processus étant tous dépendants de profils d’expression de gènes spécifiques pilotés par des changements épigénétiques, il est fort probable que les conséquences des conditions environnementales ne seront pas strictement équivalentes en fonction du modèle analysé.

L’empreinte parentale correspond à une apposition de marques épigénétiques, au cours de la gamétogénèse, marques différentes chez le mâle et chez la femelle, transmissibles au cours des mitoses après la fécondation [30]. La lecture des marques et leur maintien dans toutes les cellules somatiques de l’individu confèrent une inactivation de l’allèle paternel ou de l’allèle maternel pour un gène donné (Figure 3).

Les gènes soumis à l’empreinte parentale (GSE) constituent donc une famille particulière de gènes, caractérisée par une expression mono allèlique gouvernée par des marques épigénétiques (une liste d’une centaine de gènes est aujourd’hui disponible ;

site http://www.har.mrc.ac.uk/research/genomic_imprinting). La méthylation de l’ADN est un des mécanismes majeurs de l’initiation et du maintien de l’empreinte parentale. Elle est présente dans des régions dites différentiellement méthylées (Differentially Methylated Regions ou DMRs), riches en dinucléotides CpG, et constitue le marquage différentiel des allèles parentaux établi pendant la gamétogénèse et maintenu au cours des divisions cellulaires successives après fécondation.

L’haploïdie fonctionnelle des GSE est garante d’un développement correct de l’individu. La perte de l’haploïdie conduit soit à une perte complète de l’expression (aucun allèle n’est actif) soit à une expression bi-allèlique (les deux allèles sont actifs)

Fig. 2. — Au cours des phases précoces de développement, une importante programmation épigé- nétique pilote les grands changements d’expression des gènes (activation du génome embryonnaire). Trois marques épigénétiques sont mentionnées comme exemple ici : la méthylation de l’histone 3 (H3) sur la lysine 4 (K4), la méthylation de H3 sur la lysine 27 (K27) et la méthylation de l’ADN. Ainsi au cours du développement, la méthylation de H3K4 augmente progressivement alors que celle de H3K27 est maximale au stade 2 cellules et diminue progressivement jusqu’au stade blastocyste. La méthylation de l’ADN décroît très rapidement, par la déméthylation des génomes parentaux puis augmente avec la première vague de différenciation du trophectoderme (TE) et de la masse cellulaire interne (ICM). Par immunohistochimie, au stade blastocyste, l’ICM est bien plus marquée que le trophectoderme signant une plus forte méthylation de l’ADN (en vert). Comme contrôle, un marquage de l’ensemble des noyaux cellulaires du blastocyste est observé en présence d’iodure de propidium (en rouge).

et confère généralement des états pathologiques. Chez l’homme, les syndromes de Beckwith-Wiedemann, de Silver Russel, de Prader Willi et d’Angelman mettent justement en jeu des loci contenant plusieurs gènes soumis à l’empreinte parentale.

Plusieurs études permettent aujourd’hui de clarifier aujourd’hui les origines potentielles des perturbations épigénétiques retrouvées chez certains enfants nés après PMA (Tableau 1).

Collecte des gamètes et maturation

Chez le mâle , les marques épigénétiques gouvernant les GSE sont apposées au stade spermatogonies c’est-à-dire au cours du développement fœtal et sont maintenues au cours de la spermatogénèse. Après fécondation, ces marques résistent à la vague de déméthylation active subie par le génome paternel et sont fonctionnelles dès les

Fig. 3. — Comparaison des premières étapes de développement chez la souris, le lapin et l’homme in vivo . Il est à prendre en considération deux paramètres importants dans le développement embryonnaire précoce : la cinétique de clivage et la mise en route du génome embryonnaire.

Comme indiqué, la première division cellulaire intervient 24h après la fécondation chez la souris et le lapin, elle est un peu plus tardive chez l’homme (36h). La deuxième mitose apparaît autour de 32h chez le lapin, 48h chez la souris et 72h chez l’homme. Une accélération des mitoses est observée chez le lapin ce qui permet d’atteindre le stade 32/64 cellules avant 72h (versus 80h chez la souris, 96h chez l’homme). En parallèle, le processus génomique majeur qui est l’activation du génome embryonnaire (EGA) ne s’effectue pas au même stade de développement. L’EGA démarre au stade 2 cellules chez la souris, au stade 8/16 cellules chez le lapin et autour de 32/64 cellules chez l’homme.

Tableau 1. — Risque épigénétique dans la population générale et chez les enfants conçus par PMA Population générale

SBW SRS AS PWS Fréquence 1/13.700 1/100.000 1/16.000 1/17.500 Anomalies Epigénétiques 70 % 60 % 3 % 1 %

Anomalies Génétiques — Cytogénétiques 2 % Cas sporadiques 70 % 70 % — Disomie parentale (UDP 20 % (UPD pat) 10 % (UDPmat) 4 % (UDPpat) 25 % (UPDmat) — Mutations 5 % 5-10 % Chez les enfants conçus

SBW SRS AS PWS par PMA

Nombre de cas recensés 87 6 4 5 Anomalies Epigénétiques 100 % 100 % 100 %

Anomalies Génétiques 100 % premières différenciations cellulaires. Chez la souris, l’invalidation des gènes codant pour l’enzyme responsable de la méthylation de novo (DNMT ; voir article de

Deborah Bourc’his ci-joint) provoque une absence de méthylation de l’ADN dans les gamètes et une infertilité chez les mâles. Une corrélation entre altérations épigénétiques des spermatozoïdes et paramètres de sub-fertilité est à ce jour bien établie [31-34] sans qu’il soit possible d’affirmer que les modifications de la méthylation de l’ADN au niveau des loci des GSE aient des conséquences sur les capacités de fécondation du spermatozoïde ni une responsabilité dans des perturbations du développement fœtal et le « statut épigénétique » de l’enfant à venir.

Chez la femelle , les marques épigénétiques se mettent en place au cours de la croissance ovocytaire [39-40], c’est-à-dire une fois la puberté établie.

Chez les femmes entrées dans un protocole de PMA, le traitement hormonal permet l’obtention d’ovocytes à différents stades de maturation ou qui normalement n’auraient pas dû arriver à maturité. Il en résulte une certaine incertitude quant à leur statut épigénétique. De récentes publications, chez la souris, mettent en évidence le lien existant entre une stimulation ovarienne « forcée et accélérée » par des gonadotrophines et, d’une part l’acquisition par l’ovocyte d’un diamètre suffisant témoignant d’une maturité acquise [41] et, d’autre part la cinétique de la synthèse des enzymes ovocytaires, dont les DNMT. Une hétérogénéité d’acquisition de la méthylation des gènes Peg1/Mest et H19 a été observée au sein d’une cohorte d’ovocytes, obtenue après stimulation hormonale [42, 43]. Cette observation a été confirmée chez la femme [44]. Si la stimulation hormonale a un impact sur la transcription de certains GSE au cours de la maturation ovocytaire, elle semble en avoir aussi un plus tard au stade blastocyste et au stade postimplantation [45].

Chez la femme, des défauts de méthylation de la DMR du gène H19 liés à la MIV ovocytaire, ont été observés pour certaines patientes [44]. À ce jour, bien que plusieurs naissances de bébés aient été obtenues après MIV, les taux de grossesses et de naissances restent faibles comparés à ceux obtenus après FIV sans MIV [44] et pourraient être liés aux défauts de maturation épigénétique des ovocytes. Le temps de maturation in vitro de l’ovocyte semble avoir également un impact sur le potentiel de développement embryonnaire, une maturation courte de l’ovocyte soutiendrait un meilleur développement.

Une recommandation, déjà suivie par de nombreux praticiens, est la mise en œuvre d’une stimulation hormonale plus contrôlée (concentrations adaptées et plus faibles) limitant le recrutement d’ovocytes [46].

Ainsi, l’établissement et le maintien de l’empreinte parentale dans les spermatozoï- des et dans les ovocytes sont des processus critiques de la formation d’un gamète épigénétiquement mature dont l’obtention reste un enjeu important pour une pratique plus sûre de la PMA.

 

Conséquences épigénétiques de la FIV et de la culture in vitro des embryons

Les recherches sur l’embryon humain étant très difficiles à mener, notamment en France, l’analyse de l’impact de la FIV est basée principalement sur l’utilisation de modèles animaux.

La fécondation in vitro : dans les conditions physiologiques, le gène H19 reste méthylé sur l’allèle paternel après la fécondation alors que le génome paternel subit une déméthylation active et globale dans le zygote. Les mécanismes protégeant la DMR H19 de la déméthylation restent à ce jour, inconnus. Après FIV chez la souris, il a été trouvé une perte de méthylation du gène

H19 au stade blastocyste (Figure 4 ;

[47]). Ceci suggère que les mécanismes protégeant la méthylation du gène

H19 pourraient être déficients à la suite de la manipulation des gamètes mâles ou à la FIV.

Culture in vitro . La FIV est toujours suivie d’un temps de culture in vitro des embryons plus ou moins long. Au cours des premières divisions cellulaires, les marques épigénétiques des GSE doivent être conservées, maintenues et lues (Figure 3). Cette spécificité des GSE semble être particulièrement sensible aux modifications environnementales induites par la culture in vitro .

Chez la souris, des dérégulations épigénétiques des GSE ont été observées au stade blastocyste avant l’implantation [48, 49] et chez l’embryon après l’implantation [50, 51] lorsque le développement préimplantatoire a été réalisé in vitro dans certains milieux de culture. La composition du milieu de culture influence les altérations épigénétiques et la perte d’empreinte au stade zygote [48], au stade deux cellules [52] et jusqu’au stade blastocyste. En revanche, il semble que l’utilisation de milieu supplémenté en acides aminés permet une mise en œuvre des marques épigénétiques proche de celle observée lors du développement in vivo ([47, 48]).

L’objectif de toute PMA est d’aboutir à la formation de blastocystes aptes à se développer pour conduire à terme à la naissance d’un enfant en bonne santé. Ceci est indispensable pour réduire le nombre d’embryons transférés chez les patientes et diminuer les risques des grossesses multiples. Récemment, une susceptibilité individuelle embryonnaire aux perturbations épigénétiques durant le développement pré-implantatoire a été évoquée chez la souris [47]. Lorsque la fécondation a lieu in vitro et qu’elle est suivie de culture embryonnaire, la méthylation du gène H19 ne semble pas s’établir de la même manière quand la cinétique de développement des blastocystes est ralentie [47]. Il est connu que la culture embryonnaire peut modifier les cycles de divisions cellulaires, notamment lorsqu’elle est réalisée en présence de sérum [53]. Dans l’état actuel des connaissances, la relation de causes à effets entre cinétique de développement et maintien des marques épigénétiques ne peut être établie. Cependant, la variabilité épigénétique rencontrée pour les embryons issus de FIV, pourrait expliquer une partie des échecs d’implantation et de développement post-implantatoire observés en PMA [54]. Au cours du développement pré- implantatoire, une altération des cycles cellulaires pourrait s’accompagner d’anomalies dans l’acquisition ou le maintien des marques épigénétiques.

Fig. 4. — Le cycle de l’empreinte parentale. Au cours de la gamétogénèse, les génomes parentaux sont séparés et subissent alors de manière sexe dépendante (M génome maternel, P génome paternel) une série d’appositions de marques épigénétiques (principalement une méthylation de l’ADN mais aussi des modifications d’histones) sur des loci particuliers. Dès la fécondation, ces marques épigénétiques sont maintenues et lues dans les cellules somatiques conduisant à une expression mono allèlique des gènes concernés en fonction de l’origine parentale de l’allèle chez le fœtus puis chez l’adulte. Dans les cellules germinales, les marques épigénétiques subissent un écrasement total puis sont à nouveau apposés en fonction du sexe de l’individu au cours de la gamétogénèse.

Transfert embryonnaire. Indépendamment de la culture, la simple manipulation des embryons lors du transfert dans l’utérus pourrait avoir des conséquences épigéné- tiques. Chez la souris, une diminution des niveaux d’expression du gène Igf2 et une augmentation d’expression du gène

Ascl2 ont été observées chez des concepti collectés à J9,5 de gestation après transfert d’embryons [55]. La culture embryonnaire apparaît exacerber ces perturbations.

Les conséquences sur le développement post implantatoire ne semblent être ni de même nature ni de même amplitude qu’elles soient analysées chez l’embryon ou dans le placenta. Par exemple, une conséquence de la culture in vitro en présence de sérum, est une diminution de l’expression des gènes

Igf2 et H19 associée à une hyperméthylation du gène

H19 et une augmentation de l’expression de Gbr10 chez des embryons de souris analysés à 14 jours de gestation [53]. Récemment, il a été montré qu’à mi gestation chez la souris, les fœtus issus de FIV et de culture

Fig. 5. — Principales étapes de manipulation des gamètes et des embryons liées à la PMA évaluées en terme de risques épigénétiques dans des modèles animaux et chez l’homme.

embryonnaire in vitro ont un développement apparemment normal mais que les placentas correspondants, présentent une modification importante du profil d’expression des gènes. En particulier, une vingtaine de GSE codant principalement pour des facteurs impliqués dans le développement fœto-placentaire sont co-régulés sans qu’il y ait de modification de la méthylation des régions régulatrices [56, 57]. La confirmation de ces observations tout à fait originales signifierait qu’en cas de PMA et de manipulation in vitro des embryons, un processus compensatoire pourrait se mettre en place, orchestré par la régulation ciblée d’un panel de GSE, adaptant la fonction placentaire pour un développement plus harmonieux du fœtus.

Ces résultats sont à mettre en perspective avec les observations de petits poids de naissance, de croissance et de métabolisme modifié chez les enfants issus des techniques de PMA [3,4, 9-11, 58] et souligne la nécessité d’évaluer à plus long terme les conséquences de ces traitements sur la santé des enfants. Ces résultats suggèrent néanmoins que le risque épigénétique, au moins celui dépendant des gènes soumis à l’empreinte parentale, pourrait être minimisé quand le programme de développement des embryons a pu s’engager au-delà du stade blastocyste. Récemment, une étude menée sur une cohorte d’enfants nés après ICSI (n=77), FIV (n=35) ou fécondation naturelle (n=73) n’a détecté aucune altération épigénétique au niveau des gènes soumis à empreinte [59]. Cela n’exclut cependant pas que la PMA pourrait avoir des effets sur le profil global de méthylation et donc l’expression des gènes impliqués dans diverses fonctions [60].

 

Les marques épigénétiques, mémoire des perturbations nutritionnelles et environnementales

A cours des années récentes, une abondante littérature scientifique a souligné la contribution possible de modifications épigénétiques pour expliquer certaines réponses de type adaptative. En première intention, les analyses épidémiologiques de Barker [61] avaient abouti au concept de « syndrome métabolique » et à l’hypothèse du DOHaD (Developmental Origin of Health and Disease) selon laquelle les conditions nutritionnelles durant la gestation influencent le développement. Ainsi des conditions nutritionnelles particulières (restriction ou régime « Cafétéria » riche en lipide) appliquées chez les mères pourraient induire des perturbations importantes du développement fœtal avec un retard de croissance et un petit poids de naissance et être associées à une prédisposition aux pathologies cardiovasculaires et métaboliques chez le jeune adulte. Dans ces circonstances, il a été mis en évidence des altérations des marques épigénétiques qui joueraient le rôle de « mémoire » [62, 63]. Il est évident que les modèles animaux fournissent la possibilité d’identifier les fenêtres d’action chez les mères (au cours de la puberté, en début de gestation, au cours de la gestation…..) et d’analyser les paramètres métaboliques de la descendance pour identifier les mécanismes épigénétiques sous jacents.

Par ailleurs, des xénobiotiques ont été aussi suspectés d’altérer la fertilité et d’induire des perturbations épigénétiques. Par exemple, le diethylstilbestrol (DES), un agoniste du récepteur oestrogénique, souvent prescrit chez la femme enceinte jusque dans les années 70, a été associé au développement de cancers vaginaux et à de fréquentes anomalies de développement du tractus génital. Des études chez la souris indiquent clairement qu’un traitement prénatal ou néonatal par le DES induit une suceptibilité transgénérationnelle au développement de tumeurs du tractus génital chez la descendance (femelles et mâles) associée à une altération de la méthylation loci-spécifique [64, 65]. Le Cyclophosphamide utilisé comme agent anti cancéreux et immuno suppressif, ou la vinclozolin, un composé anti androgénique et fungicide ou encore le méthoxychlore, un composé oestrogénique et utilisé comme pesticide, présentent tous des effets sur la fonction de reproduction et sur les partenaires moléculaires épigénétiques que sont la méthylation de l’ADN et les modifications post-traductionnelles des histones altérant ainsi l’organisation chromatinienne et les profils d’expression de gènes [66].

CONCLUSION

Afin d’évaluer les effets épigénétiques et transcriptionnels des techniques de PMA, de nombreuses études se sont focalisées sur la famille des gènes soumis à l’empreinte parentale et ont utilisé les modèles animaux. Ces gènes, de par leurs caractéristiques de régulation, semblent particulièrement exposés au cours des manipulations des gamètes et d’embryons liées à la PMA et peuvent être considérés comme des « biosenseurs » ou des gènes « sentinelle » soulignant un risque épigénétique. Des altérations de l’empreinte (altérations de la méthylation et/ou perte de l’expression monoallèlique) sont effectivement induites à des stades très précoces de développement mais dans des proportions très différentes d’un blastocyste à l’autre. Cette grande variabilité individuelle rend difficile l’interprétation des modifications portées par l’embryon et le placenta après l’implantation. En effet, à un stade de développement avancé et pour des embryons au développement normal, deux hypothèses restent possibles soit tout blastocyste ayant de graves altérations épigé- nétiques ne peut poursuivre son développement, soit un processus de « réparation » permet de restaurer des marques compatibles avec un développement normal.

Un effort doit être maintenu pour définir si les altérations épigénétiques que nous avons décrites se limitent aux GSE ou si elles peuvent affecter d’autres régions chromosomiques. Enfin, toutes modifications épigénétiques soustendant des modifications d’expression des gènes, il est important de définir les gènes voire les fonctions affectées par les manipulations liées à la PMA.

Dans l’espèce humaine, les syndromes liés aux altérations épigénétiques des GSE restent des pathologies rares même chez les enfants conçus par PMA. Il est possible que l’embryon humain dans ses premières phases de vie soit plus sensible que l’embryon de souris (la cinétique de clivage embryonnaire, la phase d’activation du génome embryonnaire n’étant par ailleurs pas superposable) et que d’importantes altérations épigénétiques soient délétères et responsables de l’arrêt très précoce du développement. Si les études menées chez la souris nous permettent de souligner les risques potentiels de la PMA, il n’en est pas moins vrai que seules des recherches sur l’embryon humain permettront de répondre à toutes les questions posées.

Enfin, les études conduites dans des modèles animaux soulignent surtout l’extrême importance du suivi à très long terme des enfants issus de la PMA afin de collecter des informations sur leur état de santé et permettre une évaluation des risques de troubles métaboliques même chez l’adulte qu’ils seront devenus.

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DISCUSSION

M. Yves VILLE

La population ayant recours à la PMA est par définition hypo ou infertile. A-t-on retrouvé une homologie dans l’épigénétique différentielle des embryons et des gamètes de leurs parents ?

Effectivement, l’apposition de nombreuses marques épigénétiques et en particulier celles gouvernant l’expression des gènes soumis à l’empreinte, s’effectue au cours de la gamétogénèse, et il est justifié de penser que des altérations de méthylation observées chez le fœtus pourraient avoir comme origine une altération épigénétique au niveau des gamètes parentales. De nombreuses études ont porté sur l’identification d’altérations épigénétiques portées par les spermatozoïdes dans le cas d’infertilité masculine. Une corrélation entre altérations épigénétiques des spermatozoïdes et paramètres de sub-fertilité est à ce jour bien établie. Chez les femmes entrées dans un protocole de procréation médicale assistée, le traitement hormonal permet l’obtention d’ovocytes à différents stades de maturation ou qui normalement n’auraient pas dû arriver à maturité. Il en résulte une certaine incertitude quant à leur statut épigénétique. Par ailleurs, il a été démontré que la maturation in vitro des ovocytes ne permettait pas une apposition des marques épigéné- tiques dénuée d’altérations. Il n’est cependant pas possible d’affirmer à ce jour, que les modifications de la méthylation de l’ADN au niveau des loci des gènes soumis à l’empreinte dans les gamètes sont directement liées à des incapacités de fécondation ou d’interactions entre les gamètes et ont une responsabilité dans des perturbations du développement fœtal et le « statut épigénétique » de l’enfant à venir dans les cas de syndromes de Beckwith Wiedemann ou de Silver Russel.

M. Claude JAFFIOL

Quelle est l’influence d’une modification des rythmes des repas sur le processus de méthylation ?

La nutrition est un des facteurs environnementaux majeurs qui affecte les marques épigénétiques. En effet, l’adenosylmethionine (SAM) est le donneur universel de groupe methyl, absolument indispensable à la méthylation de l’ADN et à la méthylation des histones. Les rations alimentaires avec des taux inadéquates d’amino-acides tels que la méthionine, la serine et la glycine, ou en micro-nutriments tels le folates, la vitamine B12, la vitamine B6 peuvent affecter les taux de SAM et induire des changements épigénétiques. Une étude récente a démontré que l’exposition à la famine en période périconceptuelle pouvait avoir des conséquences en terme d’altérations épigénétiques sur la descendance (enfants et petits enfants) c’est-à-dire soixante ans après. Par ailleurs il est aussi démontré que des modifications épigénétiques suivent le rythme circadian dans différentes lignées cellulaires, révélant que l’horloge biologique interne contrôle aussi l’épigé- nome cellulaire et orchestre ainsi l’expression génique.

M. Georges DAVID

Estimez-vous que le modèle expérimental animal que vous avez développé pourrait être systématiquement utilisé pour évaluer les techniques d’AMP (différences des risques, par exemple, entre FIV simple et ICSI) ou les environnements, essentiellement les milieux de culture, ou les méthodes de congélation ?

Il me paraît important d’évaluer les risques lorsque les procédures sont modifiées, FIV versus ICSI, changement de milieux, méthodes de congélation et les modèles animaux sont très utiles pour nous renseigner au mieux sur les altérations éventuelles. Je pense qu’il serait judicieux de les utiliser de manière systématique. Cependant il faut garder à l’esprit, que les premières étapes de la vie mettant en jeu les premières mitoses et l’activation du génome embryonnaire ne s’effectuent pas avec une chronologie totalement superposable dans les différentes espèces. En particulier, l’espèce humaine présente une vitesse de clivage plus lente et une activation du génome embryonnaire plus tardive que la souris ou le lapin. Si les études menées dans les modèles animaux nous permettent de souligner les risques potentiels de ces procédures et des l’environement, il n’en est pas moins vrai que seules des recherches sur l’embryon humain permettront de répondre à toutes les questions posées.

 

* Biology of development and reproduction (BDR), UMR INRA-ENVA, Domaine de Vilvert, Bâtiment 230 — 78352 Jouy en Josas cédex France. E-mail : helene-jammes@jouy.inra.fr ** Histologie-Embryologe, Hôpital Cochin — Paris *** Membre de l’Académie nationale de médecine Tirés à part : Professeur Hélène Jammes, même adresse Article reçu et accepté le 8 février 2010

Bull. Acad. Natle Méd., 2010, 194, no 2, 301-318, séance du 16 février 2010